Oprensning af enkeltstrenget DNA ved co-polymerisering med akrylamid og elektroforese

Enstrenget DNA (ssDNA) er nyttigt til aptamerer (1), selvmontering (2), DNA- origami (3), DNA-kredsløb (4), hybridiseringssonder (5) og DNA-robotik (6). Kemisk syntetiseret DNA er som standard enkeltstrenget.

Her præsenterer vi en metode til at fremstille ssDNA fra et PCR-produkt. Det kan være en fordel at anvende et PCR-produkt i stedet for syntetisk DNA, da PCR introducerer færre mutationer end kemisk syntese og kan generere DNA’er, der er længere end grænsen på ∼120 baser for kemisk syntese. Med udgangspunkt i en klonprøve kan PCR-produkter også have en betydeligt højere sekvensrenhed end kemisk syntetiseret DNA. Høj sekvensrenhed er afgørende for høj ydeevne i DNA-kredsløbsteknologi (7).

Vores single-strand generation (SSG)-metode er skalerbar og kræver kun ét rensningstrin. Dette fjerner den uønskede komplementære streng og udfører størrelsesbaseret rensning fra resterende primer- og uønskede PCR-produkter. SSG ved co-polymerisering og elektroforese kan anvendes på produktet af avancerede PCR-protokoller såsom Gibson assemblage (8) for at skabe lange, enkeltstrengede produkter med vilkårlig sekvens. Dette kan være nyttigt i forbindelse med DNA- origami og andre selvsamlingsapplikationer.

SSG udnytter en kommercielt tilgængelig DNA-modifikation, der er kendt som en acrydit. Denne modifikation tilføjer en polymeriserbar vinylgruppe, som inkorporeres i en voksende akrylamidpolymerkæde (9). Acrydit-modificeret DNA er blevet anvendt til en række anvendelser, herunder en omskiftelig hydrogel (10), indfangning af kviksølv (11) eller PDGF (12) og til ændring af elektroforesehastigheden for specifikke sekvenser (13). Vores teknik ligner overfladisk set den metode, hvormed Church-gruppen immobiliserede polymerasekolonier i tynde polyacrylamidgeler. Acryditten er afgørende for dannelsen af klonale PCR-produkter (polonier) i nogle former for DNA-sekventering (14).

I tilfælde, hvor der er behov for betydelige mængder rent ssDNA, er vores fremgangsmåde med acrydit-modificerede primere og polyacrylamid-immobilisering en værdifuld mulighed. Vi viser også, at denne teknik kan integrere SSG, størrelsesseparation og elektroelution i et enkelt trin.

Materialer og metoder

Medmindre andet er angivet, blev reagenser erhvervet fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO) og anvendt uden yderligere rensning. DNA blev erhvervet fra IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) og anvendt uden yderligere rensning (se supplerende tabel S1 for sekvensoplysninger).

Demonstration af indfangning af acryditstrengen

Til den indledende demonstration af SSG ved co-polymerisering med acrylamid og derefter elektroforese modificerede vi en primer med acrydit og Cy5 rødt fluorescerende farvestof. Den anden primer blev købt med en grøn fluorescerende 5′ fluoresceinmodifikation. Figur 1 viser, hvordan DNA-prøven blev fremstillet ved at blande 100 μl 10 % denaturerende gel (prepolymer før påbegyndelse af polymerisationen) med 100 μl PCR-produkt (∼20 pMol produkt) og den passende masse tørt urea (5 % endelig akrylamidkoncentration, 7 M endelig urea-koncentration). DNA/præpolymeren blev indlæst i en tør brønd i en 5 % denaturerende PAGE-gel. Gelen blev opvarmet som beskrevet nedenfor, og der blev foretaget elektroforese for at adskille den grøn fluorescerende streng fra den immobiliserede rød fluorescerende streng. Den resulterende gel blev afbildet ved hjælp af et standard gelafbildningssystem med LED-belysning (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA).

Enstrengsgenerering og oprensning (vertikal gelelektroforese)

PCR blev i alle tilfælde udført med Accuprime Pfx-reaktionssættet (Life Technologies, Grand Island, NY) ved hjælp af 50 nM skabelon, 10 μM af hver primer og 8 termiske cyklusser. PCR-produktet blev denatureret ved at tilsætte fast urea til en slutkoncentration på 7 M i en 100 μl reaktion. Polyacrylamid blev fremstillet af en kommercielt fremstillet stamopløsning af 40 % akrylamid i vand med et 19:1-forhold af akrylamid:bisakrylamid (Bio-Rad, Hercules, CA). Denaturerende polyakrylamid blev fremstillet med slutkoncentrationer på 7 M urea, 20 % akrylamid og 0,25× TBE-buffer. Polymerisationen blev indledt ved at tilsætte 1 μl TEMED (N,N,N,N′,N′-tetramethylethylendiamin) og 10 μl 10 % ammoniumpersulfat til en alikvot på 1 mL denaturerende akrylamidpræpolymer. En del af denne blanding (præpolymer før påbegyndelse af polymerisationen) blev hurtigt blandet 1:1 med 100 μl PCR-produkt (fem 20-μl PCR-reaktioner i henhold til producentens anvisninger, sammenlagt) med 7 M urea (10 % akrylamid, slutkoncentration). PCR/polymeriserende akrylamidblandingen blev tilsat til en tør brønd i en standard vertikal denaturerende PAGE-gel. Fuld polymerisering af PCR/denatureringsakrylamidblandingen blev sikret ved at skylle rummet over brønden med en let strøm af argon eller 99,97 % nitrogen (for at fortrænge eventuel ilt, der hæmmer polymeriseringen). Efter ∼30 min. polymerisering opstillede vi elektroforeseriggen. Knusning af polyacrylamidet og indlæsning af de macererede stykker i brønden gav et meget bredt, uregelmæssigt formet bånd, så denne fremgangsmåde blev opgivet (data ikke vist). Polymerisation i brønden var en bedre fremgangsmåde. Vi opvarmede løbende buffer i en mikrobølgeovn til kogepunktet og tilføjede den varme (∼80°C-90°C) buffer til katodens reservoir (ved at hælde den varme buffer over de fyldte brønde) for at fremme frigivelsen af DNA’et fra brønden. Tilsætningen af den varme buffer blev fortsat, indtil gel-riggen var fyldt op til det nødvendige volumen til elektroforese. Den DNA-holdige gel var i direkte kontakt med den varme buffer, mens der blev påført spænding. Den varme buffer skal påføres straks og må ikke afkøle. Vi udførte derefter elektroforese i henhold til diagrammet i figur 1.

SB (5 mM natriumborat) og TBE-buffere kan anvendes som kørselsbuffere. SB og TBE blev fremstillet ved RT ved henholdsvis pH 8,42 og 8,36. Ved 80 °C ændres disse pH-værdier til henholdsvis 8,21 og 7,47. Denne pH-ændring er forbigående. Gelen afkøles til 30 °C-40 °C under elektroforese. Denne pH-ændring forårsagede ikke nogen mærkbar nedbrydning af DNA’et.

For at visualisere adskillelsen af de to strenge anvendte vi primere modificeret med to forskellige fluorophorer. Den mobile streng blev genereret ved hjælp af en fluoresceinmodificeret primer. Primeren (acrydit) til den immobile streng blev fremstillet med en intern Cy5-modifikation. Ved hjælp af disse to farvestoffer kunne vi visualisere separationsforløbet. Vi scannede denne gel med en gel imager (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) efter 45 min. elektroforese ved 500 V.

Som en alternativ fremgangsmåde kan PCR-produktet prækoncentreres ved standard ethanoludfældning. Pelleten kan derefter opløses i en mindre mængde akrylamidpræpolymer. I vores hænder blev den øgede koncentration i brønden opvejet af tab under udfældningen. I nogle tilfælde (f.eks. for et svagt produktbånd) kan denne fremgangsmåde være at foretrække.

Det fluorescerende bånd, der bærer det enkeltstrengede, fluoresceinmodificerede produkt, blev skåret ud af gelen under blå LED-belysning ved ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH). DNA’et blev elueret ved hjælp af standardmetoden “crush and soak” (15). Når det eluerede (genvundne) DNA var for fortyndet til effektiv ethanoludfældning, koncentrerede vi det ved ekstraktion med butanol. Produktet blev derefter udfældet med ethanol og analyseret yderligere som angivet nedenfor.

PAGE-analyse

De fluoresceinmærkede enkeltstrengede produkter (ssDNA frigivet ved denaturerende PAGE) blev analyseret for renhed ved hjælp af native PAGE. Vi resuspenderede det enkeltstrengede produkt i 10 μl og kvantificerede det ved UV-Vis-spektroskopi. Vi lavede lige molære koncentrationer af primer og enkeltstrenget produkt og elektroforese disse prøver og en 25-bp grøn fluorescerende ladder (Jena Bioscience, Jena, Tyskland) på en 15% native PAGE-gel, som blev visualiseret med Storm-scanneren for fluoresceinsignalet.

Quencher-analyse

For yderligere at fastslå, at produktet faktisk var enkeltstrenget, testede vi for hybridisering af et komplementært oligonukleotid (quench-sonde), der indeholder en 3′ quencher-modifikation. Når den er korrekt hybridiseret, placerer quenchsonden en Iowa Black quencher inden for få nanometer af 5′ fluoresceinmodifikationen på den komplementære streng. Dette medfører et kraftigt fald i fluorescensintensiteten. Quench-sonden kan kun hybridiseres til ssDNA. Hvis produktet er dobbeltstrenget, vil hybridiseringen blive blokeret, og fluorescensen vil være upåvirket. Der blev fremstillet tre gange 10 μl prøver af 100 nM fluoresceinmodificerede produkter (PCR-produkt, SSG-produkt og primerkontrol) i PCR-rør. Disse blev målt med et QuantiFluor-fluorometer (Promega, Madison, WI) for de indledende fluorescensværdier, og der blev derefter tilsat 1,1 molære ækvivalenter af quenchprobe-DNA, hvorefter de blev hvirvlet, centrifugeret og inkuberet i ca. 1 minut. Fluorescensen blev derefter registreret for at bestemme, om der opstod nogen quenching.

Sammenligning af enkeltstrengsgenereringsteknikker til aptamerproduktion

For at fastslå effektiviteten af denne metode til generering af funktionelle aptamerer købte vi en skabelon til PCR-amplifikation af en kendt aptamersekvens, der binder lysozym. Vi amplificerede denne skabelon med en fluoresceinmodificeret primer og en acryditmodificeret omvendt primer. Vi udførte SSG-protokollen som beskrevet ovenfor. Vi konjugerede lysozym til 5,8 μm carboxylat-modificerede perler (Bangs Labs, Fishers, IN) ved hjælp af standard EDC-koblingsprotokollen. Disse perler blev inkuberet med SSG-produktet, fluorescerende randomiseret DNA (ingen sekvenslighed med aptameren) og en kemisk syntetiseret fluorescerende aptamer med samme sekvens. Vi inkuberede også ucoatede perler med den kemisk syntetiserede fluorescerende aptamer som en negativ kontrol. Inkubationerne blev udført i 30 minutter, og perlerne blev derefter vasket 3 gange. Der blev udført flowcytometri på disse partikler med en FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA). Fordelingen af fluorescensintensiteter med excitation med 488-nm lys blev registreret.

Single-strandgenerering og oprensning (horisontal gelelektroforese)

En 7 M urea denaturerende polyacrylamidgel blev støbt horisontalt som tidligere beskrevet (16). Kort fortalt blev 25 mL præpolymeropløsning (7 M urea, 6 % akrylamid/bisakrylamid, SB-buffer) indledt med 84 μl APS og 20 μl TEMED. Gelpræpolymeren blev hældt i en vandret form. Formen blev derefter anbragt i en plastpose, som blev renset med nitrogen. Gelen fik lov til at polymerisere i 30 minutter. Fluoresceinmærkede og acryditmærkede DNA’er blev blandet i 1 M natriumphosphat ved pH 8,0 og annealeret ved at hæve temperaturen til 80 °C og afkøle langsomt med 0,1 °C pr. sekund til RT. Blandingen blev afkølet langsomt for at fremme intermolekylær hybridisering mellem to strenge. Præpolymerblandingen (2,5 mL) blev indledt ved at tilsætte 8,4 μl APS og 2 μl TEMED. Når det var blandet, blev 20 μl af denne opløsning tilsat til 5 μl DNA-opløsning. Denne blev derefter overført til en tør brønd i polyacrylamidgelen. For at undgå forvridninger i de elektriske feltlinjer blev de resterende brønde fyldt med ikke-DNA-holdigt akrylamid. Den fyldte gel blev anbragt i en plastikpose og renset med nitrogen. Gelen blev kørt ved 10 V/cm i 10 minutter. Den blev derefter afbildet ved hjælp af en blå LED-transilluminator og et digitalkamera. For at frigøre ssDNA’et fra den tværbundne gel i brønden blev 25 mL SB-buffer opvarmet til kogepunktet i en mikrobølgeovn. Denne varme buffer blev derefter hældt over gelen. Elektroforese blev fortsat ved 10 V/cm i 10 min. Gelen blev afbildet igen som beskrevet ovenfor til sammenligning.

Den indledende association mellem det fluorescein- og acrydit-mærkede DNA blev fremmet ved hjælp af 1 M natriumphosphatbuffer. Hvis DNA’et kun blev holdt sammen ved hybridisering, ville 7 M urea og udskiftning af buffer til 5 mM SB-buffer under elektroforese være tilstrækkeligt til at frigøre DNA’et i gelen. I stedet var det nødvendigt med varme. Dette viste, at den mobile DNA-streng er associeret eller sammenfiltret med gelen snarere end med sin komplementære DNA-streng.

Resultater og diskussion

Acrydit-modificeret DNA er immobilt under elektroforese

Af de to strenge i dsDNA PCR-produktet er acrydit-strengen fanget i co-polymeren, mens den komplementære streng er mobil. For at demonstrere dette blev der udført PCR med en primer, der var modificeret med både acrydit og et rødt fluorescerende farvestof (Cy5). Den omvendte primer blev modificeret med fluorescein. PCR-produktet blev polymeriseret i en denaturerende PAGE-gel (5%). En skematisk oversigt over processen er vist i figur 1. I første omgang er både den grønne fluorescerende og den røde fluorescerende streng samlokaliseret (gulfarvet gel). Når der påføres spænding, er det kun det fluoresceinmærkede produkt (grønt), der vandrer ind i gelen. Den acrydit- og Cy5-sammærkede streng (rød) er fastgjort i det endelige gelbillede (figur 1B). Desuden er den resterende primer fra PCR-reaktionen tydeligt synlig som et andet grønt bånd. Efter elektroforese kan det rene, enkeltstrengede produkt skæres og elueres i henhold til standardprotokoller for geloprensning.

Enstrenget DNA-verifikation

Vi isolerede enkeltstrenget, fluoresceinmodificeret DNA ved at skære og eluere det pågældende bånd. For at vise, at det produkt, der er genvundet ved denne metode, er enkeltstrenget, anvendte vi to forskellige metoder. Den første metode var native gelanalyse. Figur 2A viser et billede af en native gel, der indeholder primeren, PCR-produktet (dsDNA) og ssDNA, der er oprenset ved denne metode. Den native gel viser en klar adskillelse mellem dsDNA og ssDNA. Efter SSG med acryditprimeren (efterfulgt af skæring af gelen og eluering af produktet) er det meste af det isolerede DNA enkeltstrenget.

Vi bekræftede dette resultat ved hjælp af en quencher-modificeret hybridiseringssonde (figur 2B). Sonden var designet til at bringe en quencher i nærheden af fluorescein-delen på ssDNA-produktet. Ved hybridisering reducerer quencher-molekylet fluorescensintensiteten med ∼90%. Da sonden kun hybridiserer til ssDNA, viser dette forsøg, at det fluoresceinmodificerede produkt var enkeltstrenget. Som en negativ kontrol testede vi også PCR-produktet af dsDNA. Det dobbeltstrengede PCR-produkt var ikke i stand til at hybridisere til quencher-sonden; derfor forblev dets fluorescens stort set uændret.

Aptamere syntetiseret ved PCR oprenses ved co-polymerisering og elektroforese

Højt rent ssDNA fremstilles ved vores SSG-teknik. Vi rensede ssDNA-aptamerprodukter fra PCR ved hjælp af to metoder: (i) SSG ved co-polymerisering og elektroforese og (ii) en biotin-avidin-immobiliseringsteknik, der er beskrevet andetsteds (dvs. Polysciences Technical data sheet 753) (17,18). Enkeltstrengede aptamere blev også fremstillet ved kemisk syntese. Figur 3A viser ssDNA-aptamerer genereret ved hjælp af de tre forskellige metoder. Lane 1 er en markeringsstige til størrelsessammenligning. Lane 2 viser det rensede ssDNA, der er fremstillet ved PCR med en acryditprimer efterfulgt af co-polymerisering med akrylamid, elektroforese og gelrensning. Kun ét bånd er synligt med den korrekte størrelse for ssDNA. Lane 3 er ssDNA genereret ved PCR med en biotinyleret primer efterfulgt af oprensning med avidinbelagte magnetiske perler. Lane 4 er kemisk syntetiseret DNA med samme sekvens. Renset ssDNA aptamer fra SSG ved co-polymerisering og elektroforese viste høj ssDNA renhed.

Derpå forsøgte vi at teste, om denne procedure producerede funktionelle aptamerer. For at gøre dette genererede vi en tidligere beskrevet aptamer mod lysozym ved hjælp af PCR med modificerede primere. “Klon 1”-aptameren mod lysozym blev først fremstillet i Ellington-laboratoriet og blev oprindeligt udvalgt som en RNA-aptamer (19); andre grupper har rapporteret, at DNA-sekvensen også fungerer som en aptamer (20,21). Vi fandt, at både PCR og kemisk DNA-syntese producerede en funktionel aptamer. På baggrund af disse og andre eksperimenter konkluderer vi, at dette er et af de få, ekstraordinære tilfælde, hvor både RNA og dets overordnede DNA-sekvens binder målet. Dette er et mærkeligt og tilfældigt resultat; de fleste aptamere fungerer ikke, når de oversættes direkte til en anden kemi. Disse resultater bekræfter de mange tilfælde i litteraturen, der tyder på, at klon 1 antilysozym-aptameren er et særtilfælde.

Flowcytometrianalyse viste også, at den SSG-purificerede ssDNA-aptamer er funktionel. Figur 4B viser lysozym-belagte perler, der er eksponeret for tilfældigt DNA, den kemisk syntetiserede aptamer mod lysozym eller vores SSG-purificerede aptamer mod lysozym. Både den SSG-purificerede og den kemisk syntetiserede aptamer viste stærk binding til de lysozym-belagte perler, mens det tilfældige DNA ikke viste nogen signifikant binding til lysozymperlerne. Dette tyder på, at disse interaktioner er specifikke for aptamersekvensen. Ubelagte perler viser ingen fluorescens med eller uden aptamer, hvilket indikerer, at bindingen er specifik for proteinet.

Varme frigør DNA fra brønde

Ved oprensning af ssDNA-aptamerer fra PCR-produktet ved hjælp af SSG-metoden var det nødvendigt at varme gelen for at lette DNA-elektroforese (se “Materialer og metoder”). For at forstå, hvorfor dette var nødvendigt, anvendte vi horisontal PAGE. Uden anvendelse af varme blev det ønskede ssDNA PCR-produkt tilbageholdt i brønden på trods af brugen af 7 M urea og spændingsgradienten.

Vores første hypotese var, at denne tilbageholdelse skyldtes de 80 bp hybridisering i PCR-produktet. For at teste denne teori reducerede vi komplementariteten til 23 bp ved at anneale det fluoresceinmærkede klon 1 aptamer-DNA (betegnet F-Aptamer i figur 4) til en 23-nucleotid-lang acrydit-modificeret primer (betegnet AC-Clone1-P2 i figur 4) og udførte SSG ved co-polymerisering og elektroforese. På trods af den relativt korte hybridisering på 23 bp blev betydelige mængder af aptamer-DNA’et bevaret i brønden (figur 4A, nederste vognbane). Dette indikerede, at vores hypotese var ukorrekt, da den kortere hybridiseringsstrækning på 23 bp, som let skulle denatureres i 7 M urea, ikke tillod frigivelse af den ønskede ssDNA-streng fra brønden.

Vi testede derefter hypotesen om, at retention var afhængig af længden. Her annealerede vi et 5′-acryditmodificeret 19-nukleotid-langt oligonukleotid (betegnet AC-DNA i figur 4) til et 19-nukleotid fuldt komplementært, fluoresceinmærket oligonukleotid (betegnet F-DNA* i figur 4). På trods af den ens hybridiseringslængde blev det korte DNA let renset fra dets komplement i en denaturerende gel uden anvendelse af varme. Stort set hele den 19-nukleotiske, fluoresceinmærkede mobile streng kommer ind i gelen (figur 4A, midterste vognbane). For at vise, at den acrydit-modificerede 19-mer blev tilbageholdt, blev en streng modificeret med både fluorescein og acrydit (betegnet AC-DNA-F i figur 4) også co-polymeriseret ind i brønden (øverste vognbane) og blev tilbageholdt med succes. (se “Materialer og metoder” og Supplerende tabel S1 for sekvens- og nomenklaturdetaljer)

Efter de første 20 min. elektroforese (uden opvarmning) var det klart, at meget af klon 1 aptamer-DNA’et ikke var mobilt (på trods af en kort hybridiseringslængde). For at frigøre aptamer-DNA’et fra polyacrylamidet var det nødvendigt at opvarme gelen. Vi opvarmede running buffer til næsten kogepunktet i en mikrobølgeovn og hældte den derefter over gelen i området omkring brøndene. Elektroforese blev derefter fortsat i yderligere 20 minutter (figur 4B, nederste lane), og aptamerbåndet blev derefter mobilt. Dette nye bånd havde den samme mobilitet som det oprindelige mobile bånd, hvilket indikerer, at der var tale om den samme aptamer-art. På samme måde var dette den samme DNA-prøve, som kun gav et enkelt bånd i figur 3A. Dette forsøg viser, at det er nødvendigt at opvarme gelen for at frigøre alt langt ssDNA fra polyacrylamidet. Tilbageholdelsen af DNA i brønden skyldes ikke hybridisering, men sandsynligvis forvikling i polyacrylamidmatrixen.

Horisontal PAGE til enkeltstrengsgenerering og integreret elektroelution

Brug af en horisontal gel gør det muligt at foretage elektroelution i stedet for at skære og udtrække produktbåndet. Brugen af en anden ekstraktionskam til yderligere brønde til elektroelution og ekstraktion i horisontal PAGE gjorde SSG og elektroelution af DNA hurtigere. Vi brugte Inkscape-softwaren til at designe en separat kam til elektroelution, der var dybere og bredere end ladekammen (se supplerende materiale for den skabelon, der blev brugt til at skære kammene). Designet blev laserskåret i akryl med en CO2-laserskærer (se figur 5, A og B).

Typisk udføres PAGE ved hjælp af en lodret gel mellem glasplader. For at støbe en horisontal PAGE-gel var det nødvendigt at udelukke ilt under polymeriseringen. Vi udførte polymeriseringen i en pose fyldt med nitrogengas (eller argon) for at udelukke ilt. Gelen blev støbt med de to kamme, og elektroforese blev udført efter standardprocedurer for horisontal gelelektroforese.

Figur 5C viser en horisontal gel til SSG ved co-polymerisation og elektroforese med elektroelution. Lanes 1-4 (fra toppen) indeholder en aptamerpool. Lane 5 blev efterladt tom for at undgå utilsigtet krydskontaminering; primerstandard i Lane 6 var til stede for at skelne det uønskede bånd. Puljen blev amplificeret ved hjælp af en acrydit-modificeret primer og en fluorescein-mærket primer. Den acryditmodificerede streng blev tilbageholdt i brønden. Det fluoresceinmærkede produkt er tydeligt synligt under blå LED-belysning. Vi lod primeren løbe gennem ekstraktionsbrøndene og ud på den anden side af gelen (se figur 5D). Produktbåndene kunne derefter observeres ved at nærme sig ekstraktionsbrøndene under en transilluminator med blåt lys i realtid. Når produktbåndene kom ind i brøndene, blev de suget op med en pipette. Processen tog ca. 1 time. Udfældning og genvinding foregik derefter i overensstemmelse med de offentliggjorte aptamer-selektionsprotokoller. Dette eliminerede behovet for et separat streng-separationstrin eller en ekstraktion af gelen i løbet af natten.

Der findes flere metoder til isolering af ssDNA fra dsDNA. Metoder til oprensning af ssDNA fra PCR-produkter omfatter: induceret mobilitetsforskydning (22), immobilisering af biotin-avidinperler (18), selektiv fordøjelse med en DNase (23) og asymmetrisk tilsætning af PCR-primere (24). Disse metoder varierer med hensyn til omkostninger, renhed og skalerbarhed. En induceret mobilitetsforskydning (22) i en primer kan give problemer med amplifikationen (f.eks. kan PEG-modificerede primere fungere mindre godt i PCR), og enzymatisk fordøjelse med en DNase (23) eller kemisk nedbrydning af en streng vil efterlade urenheder (samt introducere endnu et trin i den samlede proces). Asymmetrisk tilsætning af PCR-primere (24) vil efterlade en betydelig mængde dsDNA i produktet og er meget tilbøjelig til at give amplifikationsfejl. Den mest populære metode er at ekstrahere den uønskede, biotinylerede streng ved hjælp af avidinbelagte mikrokugler (18). Denne metode har flere faldgruber. Ureageret primer optager avidin-stederne på perlerne, og biotin-avidin-interaktionen vil bryde sammen ved smeltetemperaturen for langt, dobbeltstrenget DNA (25). Dette bidrager til betydelige dsDNA-forureninger. Perlebaserede metoder er forbundet med betydelige omkostninger: 1,80 $/nMol for avidinperler plus 0,50 $/nMol for biotinprimeren. SSG ved co-polymerisering og elektroforese kræver kun acryditprimer, som koster 0,80 $/nMol. Polyacrylamid er meget billigt og kan skaleres. Elektroforisk mobilitet er en anden dimension af rensning, der er indbygget i teknikken. Både den acryditmodificerede streng og en eventuel resterende primer fjernes fra PCR-reaktionen i et enkelt trin.

Vi har vist, at SSG kan anvendes til oprensning af en funktionel aptamer. Teknikken kunne også anvendes til oprensning af en ssDNA-pulje i forbindelse med udvælgelse af DNA-aptamerer. Desuden kan SSG også finde anvendelse til generering af ssDNA til affinitetssonder eller backbones til DNA- origami (3). Det er vigtigt at bemærke, at sammenlignet med kemisk syntese har PCR-produktion af DNA en meget højere sekvenstroskab, hvilket er afgørende for anvendelser som DNA-beregning/DNA-kredsløb (26).