Real-time imaging of single-molecule co-IP
Vi viser først, at kinetikken af en protein-protein-interaktion kan måles i celleekstrakter på single-molekyle-niveau (Fig. 1). Som modelinteraktion i en cellesignalvej valgte vi interaktionen mellem Ras og Raf, som er det indledende trin i den konserverede MAPK-vej, der er hyperaktiveret i mange humane kræftformer5,6,7. Vi anvendte det Ras-bindende domæne af cRaf (cRafRBD) og en version af HRas, der indeholder en enkeltpunktsmutation, Q61L, som gør den konstitutivt aktiv6,8,9,10,11,12. Livecellebilleder af HeLa-celler, der samudtrykker disse to proteiner, viste et højt niveau af samlokalisering (Fig. 1a og Supplerende Fig. S2). Vi var i stand til at lede denne samlokalisering med rapamycin-udløst translokation af HRas til plasmamembranen13, hvilket resulterede i samtidig lokalisering af cRafRBD til de samme steder. Den konventionelle co-IP producerede også et tydeligt westernbånd, hvilket indikerer et selektivt protein-protein-interaktion mellem konstitutivt aktiv HRas og cRafRBD (Fig. 1b, venstre). Vi fandt imidlertid ud af, at dette tilsyneladende klare proteinbånd kun indeholdt mindre end 5 % af alle bytteproteinerne, hvilket tyder på, at bytteproteinerne måske ikke er stabilt bundet til lokkemidlerne, men er fjernet til flow-through-delen gennem vaskeprocesser (Fig. 1b, højre og Supplerende Fig. S3). Vi bemærker endvidere, at både livecelle-billeddannelse og co-IP-tilgange ikke kan dissekere den reelle kinetik af denne måske svage, forbigående protein-protein-interaktion.
(a) Livecelle-kolokaliseringsundersøgelse for HRas-cRafRBD-interaktion. Protein-protein-interaktioner mellem HRas og cRafRBD blev vurderet ved at observere translokationen af cRafRBD til plasmamembranen sammen med HRas. CA og DN betegner henholdsvis den konstitutivt aktive og den dominerende negative form af HRas. Skalaen er 10 μm. (b) Konventionelle co-IP-data for HRas-cRafRBD-interaktionen. Til co-IP-analyserne blev henholdsvis GST-cRafRBD (venstre) og mCherry-HRas-proteiner (højre) anvendt som lokkemad, der var immobiliseret på perler. (c) Skematisk oversigt over realtids single-molekyle co-IP. (d) TIRF-billede af immobiliseret mCherry-HRas på overfladen. Skala, 10 μm. (e) På hinanden følgende billeder fra realtidsafbildning af enkeltmolekyle co-IP. Realtidssporet af disse bindingsbegivenheder er vist i f og markeret med en rød firkant. Skala bar, 1 μm. (f,g) Eksempler på realtidsspor fra singlemolekyl co-IP-billeddannelse i realtid. Signalet består hovedsagelig af en diffus baggrundsfluorescens overlejret med en sekvens af fluorescensspidser. (h) Et negativt kontrolforsøg med overfladeimmobiliseret DN HRas (S17N). (i) Fordeling kbind for eksperimentet i f. Relevante kinetiske hastigheder blev bestemt ved hjælp af en enkelt eksponentiel kurvepasning (faste linjer). (j) Et andet negativt kontrolforsøg med overfladeimmobiliseret FLAG-eGFP. (k) Fordeling af kdiss for forsøget i f. og kblinking for forsøget i j. Relevante kinetiske hastigheder blev bestemt ved hjælp af en enkelt eksponentiel kurvejustering (gennemgående linjer). Fejlstænger angiver standardfejl (s.e.; n>200).
For at visualisere HRas-cRafRBD-interaktionen i realtid på enkeltmolekylniveau fusionerede vi HRas-genet med det rødt fluorescerende protein mCherry, og vi fusionerede cRafRBD med forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP; Fig. 1c). Vi udtrykte hvert protein i en separat gruppe af HEK293-celler. Vi anvendte strategien med single-molecule pull-down til at immobilisere mCherry-HRas på overfladen2,3 (Fig. 1c). Vi injicerede derefter det andet helcellelysat, der indeholdt eGFP-cRafRBD, på den mCherry-HRas-immobiliserede overflade som i en konventionel co-IP (Fig. 1c). Vi brugte et TIR-mikroskop (Total Internal Reflection) til at generere et evanescent elektrisk felt, der selektivt exciterede eGFP-cRafRBD’er, der kom inden for 100 nm fra overfladen. For at observere svage protein-protein-interaktioner blev enkelte eGFP-cRafRBD ankomster ved overfladen overvåget i realtid med det andet helcellelysat, der blev opretholdt i kammeret (Fig. 1c).
Figur 1f viser et typisk realtidsspor af denne enkeltmolekyle co-IP-præparation. Hvert spor blev fremstillet ved at integrere fluorescenssignalet over et cirkulært interesseområde (ROI) med et areal på 1,1 μm2 (Fig. 1e). Vi kontrollerede overfladetætheden af mCherry-HRas for at opretholde et gennemsnit på 0,5 HRas-molekyle pr. ROI (Supplerende fig. S4). Vi anvendte også Gaussian-filtrering under signalintegration og en streng tærskel for signaldetektion for at sikre, at realtidssporene rapporterede bindingsbegivenhederne for enkelt-HRas-proteiner (Fig. 1g og Supplerende Fig. S5). Hvert realtidsspor består klart af to dele: en baggrundsfluorescens og individuelle fluorescensspidser. Hvert eGFP-cRafRBD-molekyle, der bevæger sig i henhold til Brownsk bevægelse, bør bruge mindre end 50 μs pr. besøg i TIR-eksponeringslaget. Da 50 μs er tre størrelsesordener kortere end tidsopløsningen i vores billeddannelsesapparat (50 ms), giver den browniske bevægelse af mange eGFP-cRafRBD-molekyler et konstant niveau for baggrundsfluorescens. De individuelle fluorescensspidser indikerer derimod, at et enkelt eGFP-cRafRBD har vekselvirket med et molekyle på overfladen længe nok til at overleve signalintegrationen på 50 ms.
Vi analyserede dernæst den væsentlige kinetik af denne protein-protein-interaktion ved at analysere τoff, tiden mellem bindingsbegivenheder, og τon, varigheden af en enkelt bindingsbegivenhed (Fig. 1g). Ved at tilpasse enkelt eksponentielle ligninger til τoff- og τon-fordelingerne fås de kinetiske hastigheder for henholdsvis kbind og kdiss. For at sikre, at fluorescensspidserne faktisk er resultatet af en specifik HRas-cRafRBD-interaktion, udførte vi det samme eGFP-cRafRBD-bindingseksperiment med overfladeimmobiliseret dominerende negativ HRas (S17N), som har en reduceret affinitet for GTP14,15. Med den dominerende negative form var fluorescensspidsfrekvensen (kbind) alvorligt nedsat (Fig. 1h). Denne negative kontrol beviser, at fluorescensspidserne hverken er artefakter af simpel eGFP-cRafRBD-overfladeadsorption eller skyldes overfladeimmobilisering af andre proteiner med uheldige eGFP-cRafRBD-interaktioner. I stedet rapporterer disse fluorescensspidsspor troværdigt HRas-cRafRBD-bindingsbegivenheder.
Det er også bemærkelsesværdigt, at varigheden af en enkelt bindingsbegivenhed typisk kun varer et par hundrede ms (Fig. 1f). Vi undersøgte blinkdynamikken af FLAG-eGFP16 immobiliseret til en overflade med et anti-FLAG-antistof (Fig. 1j). Fotoblinkning af FLAG-eGFP sker i gennemsnit med få sekunders mellemrum, hvilket giver en kinetisk hastighed mindre end 0,3 s-1, og denne eGFP-fotoblinkningshastighed er en størrelsesorden langsommere end den kdiss, vi målte (Fig. 1k). Desuden revaliderede vi alle de enkeltmolekylære kinetiske hastigheder for kbind og kdiss ved hjælp af et co-lokaliseringskriterium, der krævede co-lokalisering af fluorescenssignaler fra mCherry-HRas- og eGFP-cRafRBD-proteinerne (Supplerende fig. S6). Således må HRas-cRafRBD-interaktionen faktisk have en hurtig omsætning, nogle få gange pr. sekund11,12.
Visualisering af mødekomplekser i Ras-Raf-interaktion
Detaljeret analyse af HRas-cRafRBD-bindingsfrekvensen (kbind) viser eksistensen af hurtige præ-equilibrerende mødekomplekser17,18,19,20,21, som er løse protein-protein-interaktionsintermediærer, der bør befolkes før dannelsen af det endelige HRas-cRafRBD-kompleks (Fig. 2). Da vi øgede koncentrationen af eGFP-cRafRBD fra 5 til 50 nM, viste kbind en parabolisk stigning (Fig. 2a), som bedst kan tilpasses ligningen 
med en Hill koefficient (n) på 1,1 (22,23), en dissociationskonstant (K1) på 43 nM for mødekompleksdannelse og en κon på 2.16 s-1 nM-1, som er den kinetiske hastighed for dannelse af den endelige bundne tilstand fra et mødekompleks (Supplerende metoder og Supplerende fig. S7). kdiss er på den anden side stort set konstant for de eGFP-cRafRBD-koncentrationer, vi undersøgte (fig. 2b). Disse kinetiske hastigheder målt med vores realtids single-molekyle co-IP er nøje i overensstemmelse med tidligere rapporter ved hjælp af bulk biokemiske assays (Supplerende tabel S1). En bemærkning er, at vi har antaget én fremherskende konformation for det endelige HRas-cRafRBD-kompleks. Selv om vores antagelse bekræftes af de unimodale fordelinger af fluorescensspidsintensiteten (Supplerende fig. S8), kan vi ikke helt udelukke muligheden for, at der er flere konformationer for HRas-cRafRBD-komplekset med flere veje, der fører til dem.
(a) kbind som en funktion af cRafRBD-koncentrationen. En lineær stigning i kbind er vist som en sammenligning. (b) kdiss som en funktion af cRafRBD-koncentrationen. kblinking fra eksperimentet i fig. 1j er vist som sammenligning. Fejlbjælker angiver s.e. (n>180). (c-e) Realtidsspor af HRas-cRafRBD-interaktion. Bemærk, at baggrundsfluorescensen stiger med HRas-overfladetætheden. Vi anvendte den samme byttekoncentration på =10 nM. (f) Stigning i baggrundsfluorescens som en funktion af HRas-overfladetætheden. Tre datasæt, opnået med 10 nM (røde cirkler), 20 nM (grønne trekanter) eGFP-cRafRBD og 20 nM rekombinant eGFP (blå diamanter), er normaliseret med det tilsvarende baggrundsfluorescensniveau målt ved en lav overflade-Ras-tæthed på 0,38 HRas pr. μm2. Fejlstænger angiver s.d. (n>100). (g) Enkeltmolekyle spikefrekvens som en funktion af baggrundsfluorescens. Datasættet, der er opnået med 10 nM eGFP-cRafRBD, er anvendt. Fejlstænger angiver s.e. (n>100).
Mærkeligt nok kan vi visualisere mødekomplekserne ved at variere overfladetætheden af HRas. Hvis baggrundsfluorescensen er et simpelt produkt af den browniske bevægelse af eGFP-cRafRBD, ville den udelukkende afhænge af bulk-koncentrationen af cRafRBD. Imidlertid stiger baggrundsfluorescensen stejlt med overfladetætheden af HRas, selv om cRafRBD-koncentrationerne holdes konstante (fig. 2c-f). Ved en høj Ras-tæthed på 6,4 HRas pr. μm2 bliver den samlede baggrundsfluorescens tre gange så høj som den, der er observeret ved 0,38 HRas pr. μm2 (fig. 2c). Vores numeriske simulering viser, at tilstedeværelsen af parallelle bindingsprocesser i en given ROI kun kan være ansvarlig for mindre end 5 % af den observerede stigning (Supplerende figur S9). Når bytteproteinerne blev ændret til rekombinante eGFP’er, som ikke interagerede med overfladeimmobiliserede HRas-proteiner, var deres baggrundsfluorescens desuden stort set invariant i det HRas-tæthedsområde, vi undersøgte (Fig. 2f, blå diamanter). Da vi således har en tæt population af aktive HRas-populationer på overfladen, synes der faktisk at være flere eGFP-cRafRBD-molekyler, der opholder sig over overfladen, end hvad der ville være forventet ved ren Brownsk diffusion. Disse mødekomplekser opstår af hurtige præ-equilibrerende interaktioner mellem HRas- og cRafRBD-proteiner24 , hvis dynamik ligger uden for vores tidsmæssige opløsning.
Vi spurgte dernæst, om mødekomplekserne faktisk tjener som substrater for det endelige HRas-cRafRBD-kompleks. Til dette formål vurderede vi frekvensen af fluorescensspikes, der blev genereret af et enkelt overfladeimmobiliseret HRas-protein. Vi har begrundet det således, at hvis mødekomplekserne er sande på vej mellemprodukter for det endelige Ras-Raf-kompleks, bør frekvensen af enkeltmolekylære spikes vokse med den stigende baggrundsfluorescens på trods af den samme bulk-cRafRBD-koncentration. For at opnå enkeltmolekylspikefrekvensen i HRas-tætte miljøer målte vi kbind ved hjælp af en mindre 3 x 3 pixel ROI (0,18 μm2) og dividerede den målte kbind-værdi med det gennemsnitlige antal HRas i hver 3 x 3 pixel ROI (Supplerende fig. S10). I det store og hele steg denne enkeltmolekylære spikefrekvens med baggrundsfluorescensen (Fig. 2g, 10 nM eGFP-cRafRBD anvendt). Vores observation tyder på, at de koncentrerede nedstrømsproteiner i form af mødekomplekser fører til dannelse af Ras-Raf-komplekset med en øget frekvens.
Single-molecule co-IP-analyse af signalproteiner i kræft
Vi har hidtil demonstreret realtidsmåling af protein-protein-interaktionskinetik under single-molecule co-IP. I disse eksperimenter er lokkemidlet og bytteproteinerne imidlertid fusioneret til fluorescerende proteintags, hvilket rejser spørgsmålet om, hvorvidt vi kan udvide denne teknik til at omfatte native proteiner. Til dette formål udtrykte vi muteret HRas (G12V) i en ikke-tumorigene human brystepitelcellelinje (MCF10A) for at omdanne dem til kræftceller25 (Fig. 3a). Disse transformerede celler, som viste serumfri vækst (Supplerende figur S11), dannede tumorer, når de blev injiceret i brystfedtpuden hos immunsupprimerede mus (fig. 3b). Tumorvæv blev fremstillet 17 dage efter xenograftningen, og kontrolvæv blev fremstillet fra de samme dele af ubehandlede nøgenmus.
(a,b) Omdannelse af MCF10A-celler til kræftceller ved retroviral HRas (G12V)-transduktion. Denne enkeltpunktsmutation er kendt for at gøre HRas konstitutivt aktiv. Injektion af kræftceller til brystkassen hos nøgenmus fører til tumordannelse. Skalaen er 5 mm. (c) Skematisk fremstilling af western blot-analyse af enkeltmolekyler. Konkurrencen mellem celle- og probe-Ras om at binde sig til det primære antistof reducerer antallet af probe-Ras, der er specifikt bundet til overfladen, og dermed reduceres antallet af fluorescerende pletter. Bemærk, at da hvert primært antistof binder til to Ras-proteiner, forsvinder en fluorescerende plet, når begge de to lyskædearme er optaget af cellulært Ras. (d) Prototypisk western blot-måling med enkeltmolekyle. 298 nM mCherry-HRas blev anvendt som målprotein. Med 32,5 nM eGFP-HRas som sonde blev målproteinkoncentrationen målprotein målt til 288±1,4 nM. Fejlstreg angiver s.d. (n=20). (e) Ras-ekspressionsniveauer målt gennem tumorigeneseprocessen fra a,b. Fejlbjælkerne angiver s.d. (n=20). (f) Skematisk fremstilling af co-IP-billeddannelse i realtid for native HRas. (g-j) Realtidsspor af co-IP-billeddannelse. De HRas-koncentrationer, der er anvendt til pull down, er 3,0 (g), 41,3 (h), 3,5 (i) og 49 nM (j). Frekvensen af fluorescensspidser blev signifikant forøget for kræftvævsekstraktet, når HRas pull-down blev forøget fra 1,6 til 22 HRas pr. μm2 (g versus h). Dette blev ikke observeret med kontrolvævsekstraktet (i versus j). (k) Skematisk fremstilling af kbind-inflation. Under sparsomme forhold med aktive lokkemidler på overfladen opnås en konstant kbinding af enkeltmolekyler, selv når lokkemidlernes tiltrækningskraft på overfladen øges (de to venstre paneler). Men efter tærsklen på 0,6 aktive lokkemadder pr. μm2 er der i gennemsnit mere end én lokkemad pr. ROI til stede. Disse flere agn har den virkning, at kbind målt fra hvert ROI øges (højre panel). (l) kbind som en funktion af HRas pull-down. Fejlstænger angiver s.e. (n>180).
I et forsøg på at beskrive denne tumorigenese kvantitativt anvendte vi tandemlag af antistoffer; et overfladeimmobiliseret biotinyleret sekundært antistof og et Ras-specifikt primært antistof1,2. Dette gjorde det muligt at indfange både naturligt, umarkeret Ras og mærket Ras (fig. 3c). Vi fulgte først Ras-ekspressionsniveauerne kvantitativt gennem tumorigeneseprocessen. Celle- eller vævsekstrakter blev blandet med et fortyndet HEK293-cellysat, som indeholdt probe Ras (eGFP-HRas) af kendt koncentration. Under reaktionsbetingelser, der fuldt ud mætter bindingsstederne for det primære antistof, fører denne blanding til en konkurrence om Ras-specifik antistofbinding mellem sonde-Ras og målcellens Ras (Fig. 3c, venstre). Antallet af probe Ras-molekyler, der er bundet til de primære antistoffer, falder, når koncentrationen af målcellulært Ras stiger. Denne konkurrerende binding mindsker antallet af fluorescenspletter på overfladen (fig. 3c, højre), som følger ligningen 
, når den normaliseres til en prøve Ras-bindingstilstand udelukkende med sonde Ras (supplerende fig. S12). Ved at måle antallet af bundne sondemolekyler ved flere forskellige fortyndinger var vi i stand til specifikt og robust at måle den molære koncentration af målcellens Ras i celle- og vævsekstrakter (Fig. 3d og Supplerende Fig. S12). Denne enkeltmolekyle-westernblot-analyse viste Ras-ekspressionsniveauer på 42 og 59 nM i 1 mg ml-1 ekstrakter af henholdsvis MCF10A-kræftceller og xenograft-tumorvæv, mens der blev målt et basisniveau på 7 nM i 1 mg ml-1 ekstrakter af kontrolvævet (Fig. 3e).
Dertil kommer, at vi også var i stand til at replikere realtids single-molekyle co-IP-billeddannelsen fra Fig. 1 og 2 på denne native Ras-indfangende overflade. Efter at have trukket HRas fra tumor- eller kontrolvævsekstrakter ned på tandemantistofoverfladen påførte vi et probecellelysat, et fortyndet HEK293-cellysat med 20 nM eGFP-cRafRBD-bytteproteiner (fig. 3f). Vi analyserede co-IP-spor i realtid for at bestemme de kinetiske hastigheder kbind og kdiss (Fig. 3g-j). Det er vigtigt at bemærke, at koncentrationsoplysningerne fra enkeltmolekyle-westernblot-analysen (fig. 3e) var afgørende for at sikre en bestemt HRas-koncentration for hver pull down, når tumor- og kontrolvævsekstrakterne havde forskellige HRas-ekspressionsniveauer. Ved hjælp af kalibreringsdataene for overflade-pull-down (Supplerende figur S13) blev koncentrationsoplysningerne endelig konverteret til en specifik overfladetæthed af pull-down HRas-proteiner (fig. 3g-j).
Vi undersøgte systematisk ændringen i kbind, mens vi øgede overfladetætheden af pull-down HRas-proteinerne præcist (fig. 3k). Vi formoder, at som følge af cellulær regulering bør kun en delmængde af HRas-proteinerne på overfladen være i GTP-belastet tilstand og vise aktive bindingsbegivenheder med bytteproteinerne. Under en sparsom tilstand, hvor afstanden mellem tilstødende aktive HRas-molekyler er langt større end diameteren af hvert ROI, bør den observerede kinetik fra hvert ROI være uafhængig af den samlede HRas-overfladeimmobilisering og blot rapportere aktiviteten af enkelt-HRas-proteiner (Fig. 3k, venstre to paneler og supplerende Fig. S14). Efterhånden som overfladen bliver mere overfyldt med aktive HRas-molekyler, bør der være en tærskel, hvor der begynder at være mere end ét aktivt HRas-molekyle pr. ROI. Når denne tærskel er overskredet, vil de ekstra aktive HRas-molekyler i hvert ROI producere yderligere fluorescensspidser, som derfor vil puste kbind op (fig. 3k, højre panel og supplerende fig. S14). Vi observerede faktisk en sådan bifasisk tendens for kbind for tumorvævet med en tærskel ved ~3 HRas, der blev trukket ned pr. μm2 (Fig. 3l).
Så under tærsklen for kbind-inflation ville den observerede spike-kinetik i vid udstrækning afspejle aktiviteten af enkelt-HRas-molekyler. Især ved 1,6-1,9 HRas, der blev trukket ned pr. μm2, blev der observeret lignende kbind-værdier på 0,28 s-1 og 0,22 s-1 for henholdsvis de af tumor- og kontrolvæv afledte HRas-proteiner (Fig. 3l). Kdiss-målingerne var også meget ens ved 2,5 s-1 (Supplerende fig. S15). Den tumorafledte enkelt-onkogene HRas havde følgelig en tilsyneladende dissociationskonstant på 180 nM, og dette svarede meget godt til dissociationskonstanten på 230 nM for den aktive HRas fra kontrolvævsekstrakt. Vores observationer indikerer en afgørende kendsgerning, nemlig at den onkogene HRas’ enkeltmolekyleaktivitet ikke er dramatisk forskellig fra en aktiveret wild-type HRas.
Så, hvad adskiller denne kræfttilstand fra den normale tilstand? Tærsklen for kbind-inflation giver os mulighed for at kvantificere en anden vigtig statistik for cellesignalproteiner, nemlig andelen af HRas-proteiner, der aktivt binder sig til cRafRBD. Intuitivt set bør tærsklen for kbind-inflation svare til en specifik overfladetæthed af “aktive” lokkemadproteiner. I vores billeddannelsessystem blev denne tærskel fundet at ligge på 0,6 aktive lokkemidler pr. μm2 , hvilket ikke afhænger af de detaljerede typer af lokkemiddel- og bytteproteiner (Supplerende figur S13). Da tærsklen for kbind-inflation blev observeret ved i alt 3 HRas, der blev trukket ned pr. μm2, blev fraktionen af aktive HRas direkte anslået til at være ca. 20 % for tumorvævet. I modsætning hertil var vi ikke i stand til at observere kbind-inflation, når selv 25 HRas-proteiner blev trukket ned pr. μm2 fra kontrolvævet (fig. 3l). Disse observationer tyder på, at det onkogene HRas, der stammer fra tumorvæv, har en højere aktiv fraktion end det HRas, der stammer fra kontrolvæv, med en størrelsesorden.
Vi stillede endelig spørgsmålstegn ved, om denne højere andel af aktivt Ras kunne være en simpel konsekvens af HRas-overekspressionen i den xenograferede tumor. De overeksprimerede HRas-proteiner kunne være i overtal i forhold til potentielle bindingspartnere, der er tilbage til rådighed for binding til eGFP-mærket Raf. For at tage direkte fat på dette spørgsmål testede vi to humane brystkræftcellelinjer, MCF-7, som har wild-type KRas, og MDA-MB-231, som har en mutant form af KRas (G13D; fig. 4). Især MDA-MB-231-cellerne er kendt for at udvise onkogenafhængighed af det muterede KRas-gen og er kritisk afhængige af aberrant KRas-signalering for deres overlevelse26,27. Ved hjælp af disse to cellelinjer er vi også i stand til at afgøre, om vores metoder gælder for KRas-signalering, som har central betydning for den molekylære diagnostik og behandling af mange kræftformer hos mennesker28.
(a,b) Enkeltmolekylære western blot-analyser af KRas-ekspressionsniveauer. eGFP-mærket KRas blev anvendt som probe Ras. Ekspressionsniveauet for wild-type KRas i MCF-7-linjen blev målt til 17,3 ± 1,3 nM, mens ekspressionsniveauet for G13D-mutanten KRas i MDA-MB-231-linjen blev målt til 5,5 ± 0,3 nM pr. 1 mg ml-1 ekstrakter. Fejlbjælkerne angiver s.d. (n=200). (c) kbind som en funktion af KRas pull down. Bemærk den samme kbind-værdi, der deles af wild-type og mutant KRas i kinetikområdet for enkeltmolekyler (den fælles flade linje). Tærsklen for kbind blev målt til at være på 1,2 pull down KRas pr. μm2 for mutant KRas fra MDA-MB-231, hvilket gav en anslået aktiv fraktion på 50 %. Denne værdi var en størrelsesorden højere end 6 % af wild-type KRas fra MCF-7, som havde en tærskelværdi på 10 KRas pulled down pr. μm2. Fejlbjælker angiver s.e. (n>150).
Vi trak direkte KRas ned fra disse celleekstrakter ved hjælp af et KRas-specifikt primært antistof. Vores enkeltmolekylære western blot-analyse viste, at wild-type KRas i MCF-7-celler har en højere koncentration (17 nM) end mutanten KRas i MDA-MB-231-celler (5,5 nM i 1 mg ml-1 ekstrakter; Fig. 4a og Supplerende Fig. S16). I betragtning af MDA-MB-231-cellernes afhængighed af KRas-onkogenet var deres mindre KRas-ekspressionsniveau en ret uventet observation. Desuden er enkeltmolekylsignaleringskinetikken for wild-type og mutant KRas stort set den samme (Fig. 4c, den fælles flade linje; se Supplerende Fig. S15 for kdiss). På den anden side løser vores realtids single-molekyle co-IP, at tærsklen for kbind-inflation for mutant KRas fra MDA-MB-231 identificeres ved 1,2 KRas pulled down per μm2, mens tærsklen observeres at være ved ~10 KRas pulled down per μm2 for wild-type KRas fra MCF-7 (Fig. 4c). Da kbind-inflationen altid forekommer ved 0,6 aktive bette pr. μm2, indikerer disse forskellige tærskler direkte, at den aktive fraktion af mutanten KRas, der binder stærkt til sit nedstrøms mål (15 nM cRafRBD), er 50%, næsten en størrelsesorden højere end 6% vist af wild-type KRas. Den højere aktive fraktion, som den onkogene mutant Ras udviser, er således tydeligvis ikke et artefakt af overekspression, fordi mutanten KRas blev udtrykt på lavere niveauer, men viste en højere aktiv fraktion end den vilde type.