Syretransformation af nordiazepam kan påvirke genfindingsvurderingen under sporanalyse af diazepam og nordiazepam i vandprøver i miljøet ved hjælp af væskekromatografi-tandem-massespektrometri

Væske-kromatografi-tandem-kvadrupol-massespektrometrisystemer

De udviklede isokratiske såvel som gradient-elutionssystemer gav god topopløsning (Rs ≥ 3,1) for diazepam og nordiazepam. I det isokratiske system var retentionstiderne 2,6 min (0,54 RSD %) og 4,1 min (0,27 RSD %) for standarder af henholdsvis nordiazepam-d5 og diazepam-d5. I overfladevandsmatrixen var retentionstiderne de samme som for standarderne, og RSD-værdierne var 0,62 % og 0,30 % for henholdsvis nordiazepam-d5 og diazepam-d5. Retentionstiderne for arbejdsstandarderne i gradientsystemet var 2,4 min (0,90 RSD %) og 2,9 min (0,70 RSD %) for henholdsvis nordiazepam og diazepam. Præcisionen af retentionstiderne for forbindelserne i behandlet spildevand er angivet i tabel 1, hvor RSD-værdierne var ≤ 0,35 %.

Diazepam og nordiazepam blev identificeret i de behandlede spildevandsprøver ved hjælp af deres karakteristiske MS/MS-transitions- og retentionstider (tabel 1). Der blev overvåget en forløberion og to fragmentioner for hver forbindelse. Med henblik på identifikation af “naturligt” forekommende diazepam og nordiazepam blev forholdet mellem de to fragmentioners toparealer sammenlignet med standardværdierne (tabel 1). Desuden blev retentionstiderne for målforbindelserne sammenlignet med retentionstiderne for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 i samme kromatografiske kørsel.

Udvikling af fastfaseekstraktionsmetoden

Stabiliteten af diazepam og nordiazepam i sure og neutrale vandige prøver

Indhentede miljøvandsprøver opbevares almindeligvis ved sur pH før analyse af nye forurenende stoffer . I denne undersøgelse blev stabiliteten af diazepam og nordiazepam undersøgt, når de blev opbevaret som arbejdsstandarder (ved pH 3,1 og pH 7,0). Det blev konstateret, at nordiazepam blev kraftigt nedbrudt, når det blev opbevaret i den sure opløsning ved stuetemperatur. I løbet af 12 dage blev 56 % af nordiazepam nedbrudt (fig. 2). Nedbrydningen var ikke så omfattende, når arbejdsopløsningen blev opbevaret ved 4 °C; efter 12 dage var 20 % af den oprindelige koncentration af nordiazepam nedbrudt. Diazepam viste sig derimod at være stabilt ved pH 3,1 ved opbevaring ved stuetemperatur og ved 4 °C (fig. 2). I løbet af de 12 dage blev kun 0,53 % og 3,1 % af diazepam nedbrudt ved henholdsvis stuetemperatur og ved 4 °C. Begge forbindelser viste sig at være stabile i 12 dage ved neutral pH. På dag 12 var responserne for diazepam og nordiazepam (ved opbevaring ved 4 °C og stuetemperatur) 101-103 % af de oprindelige responser. RSD-værdierne (n = 3) for den bestemte koncentration på de forskellige tidspunkter var ≤ 5,1 %. Reaktionen blev oprindeligt opdaget i spildevandsprøver, men eksperimenterne blev udført i forberedte opløsninger for at forenkle betingelserne og reducere muligheden for andre reaktioner/effekter i spildevandets meget komplekse matrixer.

Stabiliteten af diazepam og nordiazepam i 5 mM myresyre i renset vand, pH 3. Diazepam opbevaret ved 4 °C (hvid trekant) og i stuetemperatur (sort trekant). Nordiazepam opbevaret ved 4 °C (hvid firkant) og ved stuetemperatur (sort firkant). Eksperimentelle detaljer er beskrevet i “Stabilitetsundersøgelser af diazepam og nordiazepam i sure og neutrale vandige opløsninger”

Vores resultater viser, at nordiazepam er instabilt ved pH 3, disse resultater er i overensstemmelse med resultater i litteraturen, som viser, at nordiazepam undergår hydrolyse i sure opløsninger. Archontaki et al. fandt, at nordiazepam blev hydrolyseret i sure vandige opløsninger, og at det første trin i nedbrydningen var reversibelt. Resultaterne i den foreliggende undersøgelse kan imidlertid synes at være i modstrid med resultaterne fra en nyere undersøgelse, hvor det blev konstateret, at nordiazepam (og diazepam) var mere stabilt ved pH 2 end ved pH 7 . Forskellen er faktisk forventet, når man tager de forskellige strategier for bestemmelse af genfindelse i betragtning. Da omdannelsen af nordiazepam omvendes under inddampning og opvarmning, er der måske ingen praktiske konsekvenser for rutinemæssig anvendelse af metoden. Det er kun, når genfindelsen vurderes i henhold til anbefalingerne fra Matuszewski et al. i kombination med nordiazepams ustabilitet ved lav pH, at vi får et tab af forbindelsen og dermed en tilsyneladende høj genfindelse.

Genfindelserne ved fastfaseekstraktion for simulerede miljøvandprøver, opbevaret ved lav prøve-pH

Genfindelserne ved fastfaseekstraktion og matrixeffekten blev bestemt i behandlede vandprøver ved LC-MS ved hjælp af den tilgang, der er foreslået af Matuszewski et al. , nærmere oplysninger findes i “Metodevalidering”. Ekstraktionsgenvindingen blev bestemt for de isotopmærkede standarder, diazepam-d5 og nordiazepam-d5, da de mærkede forbindelser ikke forventes at blive fundet i de miljømæssige matricer . I denne undersøgelse blev arbejdsstandarderne diazepam-d5 og nordiazepam-d5 opbevaret i 5 mM myresyre i renset vand pH 3,1/acetonitril (90/10, v/v) i højst 1 uge ved 8 °C og blev anvendt til fremstilling af sæt A-C.

De relative ekstraktionsgenvindingsværdier, bestemt ved en lav og en høj koncentration, er angivet i tabel 2 (ekstraktionsmetoden er angivet i “Prøveforberedelse og fastfaseekstraktion”). Ekstraktionsgenvindingerne var højere for nordiazepam-d5 end for diazepam-d5. For nordiazepam-d5 var de relative ekstraktionsgenvindingsværdier 114 ± 8,1 % og 117 ± 21 % ved henholdsvis lav og høj koncentration. De opnåede RSD-værdier for diazepam-d5 var 6,0 % og 24 % for henholdsvis den lave og høje koncentration (tabel 2). Der opnås undertiden høje RSD-værdier (≥ 18 %) for ekstraktionsproceduren med fastfaseekstraktion ved bestemmelse på sporniveau i komplekse matricer . Desuden er der tidligere i litteraturen rapporteret om høje ekstraktionsgenvindingsværdier (≥ 100 %) for nordiazepam i vandprøver i miljøet . Som det vil blive diskuteret nedenfor, kan de høje genfindingsværdier være korreleret med en kemisk ligevægt mellem nordiazepam og et omdannelsesprodukt.

Den absolutte ekstraktionsgenvinding for nordiazepam-d5 blev bestemt til 139 ± 21 % og matrixeffekten til 119 ± 3,0 %. Den høje absolutte ekstraktionsgenvinding for nordiazepam-d5 kan delvis forklares ved, at nordiazepam-d5 blev udsat for ionforstærkning i MS-grænsefladen. Vi viste imidlertid, at de høje ekstraktionsgenvindinger (> 100 % for den relative ekstraktion, som diskuteret ovenfor) ikke kun skyldtes matrixeffekter i ESI-kilden. Dette blev bestemt af de relative ekstraktionsgenvindinger, der blev opnået i henhold til Matuszewski et al. hvor de ekstraherede og de ikke-ekstraherede prøver blev injiceret i LC-MS/MS-systemet opløst i den samme matrix. For yderligere at verificere, at de høje ekstraktionsgenvindinger ikke var korreleret med en proces i massespektrometerets grænseflade, blev ekstraktionsgenvindingerne for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 desuden bestemt ved anvendelse af en anden detektionsteknik, LC-UV. Genfindingen for en ekstraheret prøve af nordiazepam-d5 i fosfatbuffer (pH 7,0), der blev analyseret med både LC-MS/MS og LC-UV, blev bestemt til henholdsvis 159 og 153 % (n = 2). Vi konkluderede, at de høje ekstraktionsgenvindinger for nordiazepam ikke i høj grad kunne tilskrives nogen proces i massespektrometeret.

Sammenfattende kan det konkluderes, at selv om de opnåede ekstraktionsgenvindinger og RSD-værdierne var høje, ville de sandsynligvis fremstå som rimelige, da koncentrationerne af målforbindelserne var lave (50 og 250 pM), og fordi forbindelserne blev ekstraheret fra en kompleks matrix. I denne undersøgelse ønskede vi at påvise, at disse høje genfindingsværdier opnået for nordiazepam kunne korreleres med en kemisk ligevægt mellem nordiazepam og et omdannelsesprodukt fundet af Archontaki et al. .

Regenerering af nordiazepam under prøveforberedelsen

Når opbevarede opløsninger af diazepam og nordiazepam (pH 3.1, ved stuetemperatur, “The stability of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous samples”) blev brugt til at spike fosfatbufferen og derefter underkastet ekstraktion i fast fase, var de responser, der blev opnået fra de rekonstituerede ekstrakter af nordiazepam, større sammenlignet med de responser, der blev opnået fra de uekstraherede opbevarede opløsninger. Ved ekstraktionen i fast fase var toparealet af nordiazepam steget fra 26 arealtællinger (2,7 RSD %, n = 3) til 45 arealtællinger (14,6 RSD %, n = 3).

For at verificere, at nordiazepam blev regenereret under fastfaseekstraktionen, blev en opbevaret prøve af nordiazepam-d5 (som gav et topområde på 1470 for fragmentionen m/z 213) og en behandlet prøve af nordiazepam-d5 (med et topområde på 1790) injiceret i LC-MS/MS-systemet. Ud over SRM-kanalen for nordiazepam-d5 (276 → 213) blev der erhvervet to yderligere SRM-kanaler, tabel 1. De lagrede prøver af nordiazepam-d5 blev injiceret (n = 6), og forholdet mellem SRM-overgangene blev bestemt til at være 1,4 (3,8 RSD %, fragmentionforhold m/z (276 → 213)/(276 → 165) og 1,0 (3,5 RSD %, fragmentionforhold m/z (276 → 213)/(276 → 140)). For den forarbejdede prøve af nordiazepam-d5 var forholdet mellem SRM-transitionerne det samme, dvs. 1,4 og 1,0. Der var således ingen væsentlige forskelle i fragmentionforholdet mellem de lagrede og de forarbejdede prøver. Desuden var retentionstiderne de samme for begge prøver. Det blev konkluderet, at det var nordiazepam-d5, der blev påvist i både de opbevarede og forarbejdede prøver.

Archontaki et al. fandt, at nordiazepam blev omdannet i sur vandopløsning til det mellemliggende stof N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid med molekylformlen C15H13N2O2Cl og den monoisotopiske masse 288,1 Da. Transformationsproduktet blev krystalliseret og analyseret ved LC-UV, GC-MS, 1H- og 13C-NMR og IR-spektroskopi. Den kemiske ligevægt mellem mellemproduktet og nordiazepam var reversibel, men den videre omdannelse af mellemproduktet til det endelige nedbrydningsprodukt (C13H10NOCl) var imidlertid ikke reversibel. I den foreliggende undersøgelse blev en ion med en retentionstid på 3,0 min og et masse/ladningsforhold på 289,0 påvist ved LC-MS i en opbevaret opløsning (pH 3,1) af nordiazepam. Denne ion kan svare til + af omdannelsesproduktet af nordiazepam. Desuden svarede isotopmønsteret for ionen ved 3,0 min til isotopmønsteret for et kloratom. Desuden eluerede den kromatografiske top før nordiazepam, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af separationen af nordiazepam og N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid i det omvendtefasesystem, der blev anvendt af Archontaki et al. Således var den påviste top i den opbevarede sure vandopløsning i denne undersøgelse højst sandsynligt N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid. Desuden var forholdet mellem toparealet af nordiazepam og N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid 0,75 (n = 2) i denne opbevarede vandopløsning i den foreliggende undersøgelse. I de inddampede methanolblandinger (eksperimentelle detaljer beskrevet i “Stabilitetsundersøgelser af diazepam og nordiazepam i sure og neutrale vandige opløsninger”) steg forholdet mellem toparealet af nordiazepam og N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid imidlertid til 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), dvs, toparealet af nordiazepam steg, og toparealet af N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid faldt i sammenligning med den prøve, der ikke blev inddampet. Der blev ikke påvist nogen toppe for N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid eller nordiazepam i blindprøven. Disse resultater tyder stærkt på, at den kemiske ligevægt mellem nordiazepam og det omdannelsesprodukt af nordiazepam, som Archontaki et al. karakteriserede, flyttede sig fra N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid til nordiazepam under inddampningen af SPE-ekstrakterne. Der blev ikke påvist nogen top, der kunne korreleres med det endelige nedbrydningsprodukt (C13H10NOCl) af nordiazepam.

Det blev konkluderet, at nordiazepam let blev omdannet til N-(2-benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid i den sure vandopløsning. Interessant nok blev nordiazepam regenereret under ekstraktionsprocessen i fast fase. Ved at anvende de opbevarede opløsninger af nordiazepam ved pH 3,0 som reference i beregningerne af ekstraktionsgenvindingen overvurderes ekstraktionsgenvindingen således. Disse resultater er af betydning i forbindelse med metodevalidering, dvs. i forbindelse med vurdering af opbevaringsbetingelser, ekstraktionsgenvinding og matrixeffekter. Desuden kan transformationen af nordiazepam påvirke de samlede analyseresultater, hvis der ikke anvendes en isotopmærket analog til nordiazepam som intern standard. Det skal også understreges, at transformationen af nordiazepam kan påvirke metodens nøjagtighed, ikke kun under opbevaring forud for ekstraktion i fast fase, men også afhængigt af pH-værdien af den anvendte opløsning, f.eks. rekonstituering af de tørrede SPE-ekstrakter.

Metodevalidering

Den udviklede metode blev valideret ved brug af de isotopmærkede analoger, diazepam-d5 og nordiazepam-d5 (“metodevalidering”), da disse forbindelser ikke blev påvist i miljøprøverne. Fordelen ved at anvende de mærkede analoger til metodevalidering er, at metoden kan valideres på sporstofniveau i den faktiske matrix, hvori analysanderne kvantificeres . De relative ekstraktionsgenvindinger i de behandlede spildevandsprøver var ≥ 87 % for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 ved høj og lav koncentration (tabel 3). De opnåede værdier ligger inden for de områder, der kan forventes, når koncentrationer af lægemidler på sporniveau ekstraheres fra komplekse matricer . De absolutte ekstraktionsgenvindingsværdier var lavere, 63-86 %, da analysanderne blev underkastet ionundertrykkelse (tabel 3). Ved den lave koncentration var matrixeffekterne (ME %) 76 ± 14 % og 88 ± 14 % for henholdsvis diazepam-d5 og nordiazepam-d5 (tabel 3). Ved den høje koncentration var matrixeffekten og RSD-værdierne i samme størrelsesorden som ved den lave koncentration. Disse tal for ME % ligger inden for det acceptable område, da resultater fra andre undersøgelser viser, at den matrixeffekt, der opnås med miljøvandsmatricer, kan være relativt høj. Metodens nøjagtighed blev bestemt ved bestemmelse af SPE-genfindingsværdierne ved lav og høj koncentration af diazepam-d5 og nordiazepam-d5 (tabel 3). De relative genfindelser var 88 ± 7,6 % og 87 ± 12 % for diazepam-d5 ved henholdsvis lav og høj koncentration og 98 ± 7,8 % og 99 ± 6,1 % for nordiazepam-d5.

Kromatografisystemets præcision, udtrykt som RSD-værdierne af retentionstiderne for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 i ekstraherede spildevandsprøver, var ≤ 0,62%. RSD-værdierne for toparealerne for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 i de ekstraherede spildevandsprøver var ≤ 7,8 % (“The liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry systems”). Desuden var lineariteten, udtrykt som korrelationskoefficienten (R2) for kalibreringskurverne i de behandlede spildevandsprøver, 0,988 og 0,957 for henholdsvis diazepam og nordiazepam.

Der blev i denne undersøgelse ikke observeret nogen carryover i LC-MS/MS-systemet, da der ikke blev påvist nogen toppe af analyterne eller de isotopmærkede forbindelser i nogen af de injicerede rensede Millipore-vandprøver. Der var ingen tegn på, at der var sket krydskontaminering under prøvehåndteringen eller ekstraktionen i fast fase, da de ekstraherede fosfatbufferprøver ikke indeholdt nogen af målforbindelserne. Risikoen for at opnå falsk positive resultater som følge af selvkontaminering blev derfor anset for at være minimeret i denne undersøgelse.

LOQ og LOD for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 blev bestemt i behandlede spildevandsprøver. Kvantificeringsgrænserne blev fastsat til 5,0 pM (1,4 ng L-1) for både diazepam-d5 og nordiazepam-d5, hvor signal/støj-forholdet var ca. 10, og den opnåede præcision var 12,7 og 15,9 RSD % (n = 3) for de respektive forbindelser (tabel 3), dvs. inden for den fastsatte præcision på 20 % . De opnåede LOQ-værdier i den foreliggende undersøgelse ligger inden for det område, der er opnået i andre undersøgelser for diazepam og nordiazepam i behandlede spildevandsprøver . I den pågældende undersøgelse blev der imidlertid ekstraheret 200 mL behandlet spildevand til sammenligning med 75 mL i den metode, vi har præsenteret. Detektionsgrænserne var henholdsvis 1,7 pM (0,49 ng L-1 ) og 2,0 pM (0,55 ng L-1 ) for diazepam-d5 og nordiazepam-d5 (tabel 3).

Som beskrevet ovenfor (“Stabiliteten af diazepam og nordiazepam i sure og neutrale vandige prøver”, fig. 2) viste diazepam og nordiazepam sig at være stabile i 12 dage ved en prøve pH 7.0, når de blev opbevaret ved stuetemperatur eller ved 4 °C.

Kvantificering af diazepam og nordiazepam i miljøvandprøver

Den udviklede LC-MS/MS-metode blev anvendt på miljøvandprøver til bestemmelse af diazepam og nordiazepam. Det skal understreges, at den udviklede metode kan anvendes til bestemmelse af diazepam og nordiazepam i miljøprøver under sure forhold, hvis der tilsættes ideelle interne standarder til prøverne før opbevaring, dvs. isotopmærkede forbindelser af målforbindelserne. I denne undersøgelse blev de isotopmærkede forbindelser, diazepam-d5 og nordiazepam-d5, anvendt som interne standarder for at kompensere for den potentielle omdannelse af forbindelserne og andre tab samt variationer under analysen.

Afbehandlede spildevands- og overfladevandsprøver blev analyseret for diazepam og nordiazepam. Der var ingen signifikante forskelle, på 5%-niveau i en t-test, mellem de ionforhold, der blev opnået for standardopløsninger (tabel 1), og dem, der blev opnået for “naturligt” forekommende diazepam eller nordiazepam (P ≥ 0,07). Koncentrationerne af diazepam og nordiazepam blev bestemt til henholdsvis 8,5 (2,4 ng L-1) og 66 pM (18 ng L-1). I prøver fra samme spildevandsbehandlingsanlæg, der blev indsamlet 14 dage senere, blev koncentrationerne bestemt til henholdsvis 7,5 (2,1 ng L-1) og 75 pM (20 ng L-1) for diazepam og nordiazepam. Koncentrationerne af nordiazepam blev således bestemt til at være omkring en størrelsesorden højere end koncentrationerne af diazepam. Disse resultater er i overensstemmelse med resultater fra andre undersøgelser af spildevandsudledninger . I nogle behandlede spildevandsprøver, der er beskrevet i litteraturen, blev nordiazepam desuden kvantificeret, men diazepam blev ikke påvist . I den foreliggende undersøgelse blev der hverken påvist diazepam eller nordiazepam i overfladevand indsamlet fra Fyris-floden 3 km opstrøms fra rensningsanlægget Kungsängsverket, hvilket tyder på få antropogene spildevandsemissioner opstrøms.