Tandem-massespektrometri

Fragmentering af ioner i gasfasen er afgørende for tandem-massespektrometri og finder sted mellem de forskellige faser af masseanalysen. Der findes mange metoder til fragmentering af ionerne, og disse kan resultere i forskellige typer fragmentering og dermed forskellige oplysninger om molekylets struktur og sammensætning.

In-source-fragmenteringRediger

Ofte er ioniseringsprocessen tilstrækkelig voldsom til at efterlade de resulterende ioner med tilstrækkelig intern energi til at fragmentere i massespektrometeret. Hvis produktionerne forbliver i deres ikke-ligevægtstilstand i et moderat tidsrum før auto-dissociation, kaldes denne proces metastabil fragmentering. Dyse-skimmer-fragmentering henviser til den målrettede induktion af in-source-fragmentering ved at øge dyse-skimmer-potentialet på instrumenter, der normalt er baseret på elektrospray. Selv om in-source-fragmentering giver mulighed for fragmenteringsanalyse, er der teknisk set ikke tale om tandem-massespektrometri, medmindre metastable ioner masseanalyseres eller udvælges før auto-dissociation, og der udføres en anden analysefase på de resulterende fragmenter. In-source-fragmentering kan anvendes i stedet for tandem-massespektrometri ved hjælp af EISA-teknologien (Enhanced in-Source Fragmentation Annotation), som genererer fragmentering, der direkte matcher tandem-massespektrometri-data. Fragmenter, der observeres ved EISA, har en højere signalintensitet end traditionelle fragmenter, som lider tab i kollisionscellerne i tandemmassespektrometre. EISA gør det muligt at indsamle fragmenteringsdata på MS1-masseanalysatorer som f.eks. time-of-flight- og single quadrupol-instrumenter. In-source-fragmentering anvendes ofte sammen med tandemmassespektrometri (med post-source-fragmentering) for at muliggøre to fragmenteringstrin i et pseudo MS3-eksperiment.

Kollisionsinduceret dissociationRediger

Post-source-fragmentering er oftest det, der anvendes i et tandemmassespektrometrieksperiment. Der kan også tilføres energi til ionerne, som normalt allerede er vibrationsmæssigt exciterede, gennem kollisioner efter kilden med neutrale atomer eller molekyler, absorption af stråling eller overførsel eller indfangning af en elektron fra en flerladet ion. Kollisionsinduceret dissociation (CID), også kaldet kollisionsaktiveret dissociation (CAD), indebærer kollision af en ion med et neutralt atom eller molekyle i gasfasen og efterfølgende dissociation af ionen. For eksempel kan man overveje

AB + + + M ⟶ A + B + + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ {B+}+ M}}}

hvor ionen AB+ kolliderer med den neutrale art M og efterfølgende går fra hinanden. De nærmere detaljer i denne proces beskrives ved hjælp af kollisionsteori. På grund af forskellige instrumentkonfigurationer er der to forskellige hovedtyper af CID mulige: (i) stråle-type (hvor forløberioner fragmenteres under flyvningen) og (ii) ionfældetype (hvor forløberioner først fanges og derefter fragmenteres).

En tredje og nyere type CID-fragmentering er højere-energi kollisionsdissociation (HCD). HCD er en CID-teknik, der er specifik for orbitrap-massespektrometre, hvor fragmenteringen finder sted uden for ionfælden, den sker i HCD-cellen (i nogle instrumenter kaldet “ion routing multipole”). HCD er en fragmentering af fældetypen, som har vist sig at have egenskaber af stråletypen. Der findes frit tilgængelige store højopløselige tandemmassespektrometri-databaser med høj opløsning (f.eks. METLIN med 850 000 molekylære standarder hver med eksperimentelle CID MS/MS-data), og de anvendes typisk til at lette identifikationen af små molekyler.

Metoder til indfangning og overførsel af elektronerRediger

Den energi, der frigives, når en elektron overføres til eller indfanges af en flerladet ion, kan fremkalde fragmentering.

ElektronindfangningsdissociationRediger

Hvis en elektron tilføjes til en flerladet positiv ion, frigives Coulomb-energien. Tilføjelse af en fri elektron kaldes elektron-indfangningsdissociation (ECD) og er repræsenteret ved

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmenter {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->fragmenter}}}}

for et multipelt protoneret molekyle M.

ElektronoverførselsdissociationRediger

Tilførsel af en elektron gennem en ion-ion-reaktion kaldes elektronoverførselsdissociation (ETD). I lighed med elektronindfangningsdissociation fremkalder ETD fragmentering af kationer (f.eks. peptider eller proteiner) ved at overføre elektroner til dem. Den blev opfundet af Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka og Jarrod Marto ved University of Virginia.

ETD bruger ikke frie elektroner, men anvender radikale anioner (f.eks. anthracen eller azobenzen) til dette formål:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmenter {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}}\left^{(n-1)+}}\right]^{*}+{\ce {A->fragmenter}}}}

hvor A er anionen.

ETD kløver tilfældigt langs peptidryggen (c- og z-ioner), mens sidekæder og modifikationer som f.eks. fosforylering efterlades intakte. Teknikken fungerer kun godt for ioner med højere ladningstilstand (z>2), men i forhold til kollisionsinduceret dissociation (CID) er ETD fordelagtig til fragmentering af længere peptider eller endog hele proteiner. Dette gør teknikken vigtig for top-down-proteomik. Ligesom ECD er ETD effektiv til peptider med modifikationer som f.eks. fosforylering.

Elektronoverførsel og højere-energi kollisionsdissociation (EThcD) er en kombination af ETD og HCD, hvor peptidprækursoren indledningsvis udsættes for en ion/ion-reaktion med fluoranthen-anioner i en lineær ionfælde, som genererer c- og z-ioner. I andet trin anvendes HCD-ionfragmentering på alle ETD-ioner for at generere b- og y-ioner før den endelige analyse i orbitrap-analysatoren. Denne metode anvender dobbelt fragmentering til at generere ion- og dermed datarige MS/MS-spektre til peptidsekventering og PTM-lokalisering.

Negativ elektronoverførselsdissociationRediger

Fragmentering kan også forekomme med en deprotoneret art, hvor en elektron overføres fra arten til et kationisk reagens i en negativ elektronoverførselsdissociation (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmenter {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragmenter}}}

Efter denne overførselsbegivenhed undergår den elektronmangelfulde anion en intern omlægning og fragmenteres. NETD er ion/ion-analogen til elektronafløsningsdissociation (EDD).

NETD er kompatibel med fragmentering af peptid og proteiner langs rygsøjlen ved Cα-C-bindingen. De resulterende fragmenter er normalt a– og x-type produktioner.

Elektron-detachment-dissociationRediger

Elektron-detachment-dissociation (EDD) er en metode til fragmentering af anioniske arter i massespektrometri. Den tjener som en negativ modmodus til elektronindfangningsdissociation. Negativt ladede ioner aktiveres ved bestråling med elektroner med moderat kinetisk energi. Resultatet er udkastning af elektroner fra det ioniske modermolekyle, hvilket forårsager dissociation via rekombination.

LadningsoverførselsdissociationRediger

Reaktionen mellem positivt ladede peptider og kationiske reagenser, også kendt som ladningsoverførselsdissociation (CTD), er for nylig blevet demonstreret som en alternativ højenergifragmenteringsvej for peptider med lav ladningstilstand (1+ eller 2+). Den foreslåede mekanisme for CTD ved brug af heliumkationer som reagens er:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmenter {\displaystyle {\ce {\ce {{^{1}+}+He+->}}}\left^{2}+}}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragmenter}}}

De første rapporter viser, at CTD forårsager spaltning af Cα-C-bindinger på rygsøjlen af peptider og giver a– og x-type produktioner.

FotodissociationRediger

Den energi, der kræves til dissociation, kan tilføjes ved fotonabsorption, hvilket resulterer i ionfotodissociation og er repræsenteret ved

AB + + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}}

hvor h ν {\displaystyle h\nu }

repræsenterer den foton, der absorberes af ionen. Der kan anvendes ultraviolette lasere, men de kan føre til overdreven fragmentering af biomolekyler.

Infrarød multiphoton dissociationRediger

Infrarøde fotoner vil opvarme ionerne og forårsage dissociation, hvis der absorberes nok af dem. Denne proces kaldes infrarød multiphoton dissociation (IRMPD) og udføres ofte med en kuldioxidlaser og et ionfælde-massespektrometer som f.eks. et FTMS.

Blackbody infrared radiativ dissociationRediger

Blackbody-stråling kan anvendes til fotodissociation i en teknik, der kaldes blackbody infrared radiativ dissociation (BIRD). Ved BIRD-metoden opvarmes hele massespektrometerets vakuumkammer for at skabe infrarødt lys. BIRD bruger denne stråling til at fremkalde stadig mere energiske vibrationer i ionerne, indtil en binding brydes, hvorved der opstår fragmenter. Dette svarer til infrarød multiphoton-dissociation, som også anvender infrarødt lys, men fra en anden kilde. BIRD anvendes oftest med Fouriertransform ioncyklotronresonansmassespektrometri.

Overfladeinduceret dissociationRediger

Med overfladeinduceret dissociation (SID) er fragmenteringen et resultat af en ioners kollision med en overflade under højt vakuum. I dag anvendes SID til at fragmentere en lang række ioner. For år tilbage var det kun almindeligt at anvende SID på enkeltladede arter med lavere masse, fordi ioniseringsmetoder og masseanalysatorteknologier ikke var avancerede nok til at danne, overføre eller karakterisere ioner med høj m/z korrekt. Med tiden har selvassemblerede monolagsoverflader (SAM’er) bestående af CF3(CF2)10CH2CH2CH2S på guld været de mest anvendte kollisionsoverflader til SID i et tandemspektrometer. SAM’er har fungeret som de mest ønskelige kollisionsmål på grund af deres karakteristiske store effektive masse for kollision af indkommende ioner. Desuden er disse overflader sammensat af stive fluorcarbonkæder, som ikke dæmper projektilionernes energi væsentligt. Fluorcarbonkæderne er også fordelagtige på grund af deres evne til at modstå en let elektronoverførsel fra metaloverfladen til de indkommende ioner. SID’s evne til at frembringe underkomplekser, der forbliver stabile og giver værdifulde oplysninger om konnektivitet, er uovertruffen i forhold til andre dissociationsteknikker. Da de komplekser, der fremstilles ved hjælp af SID, er stabile og bevarer ladningsfordelingen på fragmentet, giver det et unikt spektrum, hvor komplekset er centreret omkring en smallere m/z-fordeling. SID-produkterne og den energi, ved hvilken de dannes, er udtryk for kompleksets styrke og topologi. De unikke dissocieringsmønstre bidrager til at afdække kompleksets kvaternære struktur. Den symmetriske ladningsfordeling og dissociationsafhængighed er unikke for SID og gør de frembragte spektrer særprægede i forhold til enhver anden dissociationsteknik.

SID-teknikken kan også anvendes til ion-mobilitetsmassespektrometri (IM-MS). Tre forskellige metoder til denne teknik omfatter analyse af karakterisering af topologi, intersubunit-forbindelse og graden af udfoldning for proteinstruktur. Analyse af udfoldning af proteinstruktur er den mest almindeligt anvendte anvendelse af SID-teknikken. I forbindelse med ion-mobilitetsmassespektrometri (IM-MS) anvendes SID til dissociation af de kildeaktiverede forløbere af tre forskellige typer proteinkomplekser: C-reaktivt protein (CRP), transthyretin (TTR) og concanavalin A (Con A). Denne metode anvendes til at observere udfoldningsgraden for hvert af disse komplekser. Til denne observation viste SID de strukturer af forløberioner, der eksisterer før kollisionen med overfladen. IM-MS anvender SID som et direkte mål for konformationen for hver enkelt proteins underenhed.

Fourier-transform ioncyklotronresonans (FTICR) er i stand til at give ultrahøj opløsning og høj massepræcision til instrumenter, der foretager massemålinger. Disse egenskaber gør FTICR-massespektrometre til et nyttigt redskab til en lang række anvendelser som f.eks. adskillige dissociationseksperimenter som kollisionsinduceret dissociation (CID), elektronoverførselsdissociation (ETD) og andre. Desuden er der blevet gennemført overfladeinduceret dissociation med dette instrument til undersøgelse af grundlæggende peptidfragmentering. Specifikt er SID blevet anvendt til undersøgelse af energetik og kinetik af fragmentering i gasfase i et ICR-instrument. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at forstå gasfasefragmenteringen af protonerede peptider, peptidioner med ulige elektroner, ikke-kovalente ligand-peptidkomplekser og ligerede metalklynger.