Nøgleenzymer og -komponenterRediger
V(D)J-rekombinationsprocessen formidles af VDJ-rekombinase, som er en mangfoldig samling af enzymer. De involverede nøgleenzymer er rekombinationsaktiverende gener 1 og 2 (RAG), terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT) og Artemis-nuklease, et medlem af den allestedsnærværende non-homologous end joining (NHEJ)-vej for DNA-reparation. Flere andre enzymer er kendt for at være involveret i processen og omfatter DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PK), X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), DNA-ligase IV, non-homologous end-joining factor 1 (NHEJ1; også kendt som Cernunnos eller XRCC4-like factor ), den nyligt opdagede Paralog of XRCC4 og XLF (PAXX) og DNA-polymeraser λ og μ. Nogle involverede enzymer er specifikke for lymfocytter (f.eks. RAG, TdT), mens andre findes i andre celletyper og endda ubiquitært (f.eks. NHEJ-komponenter).
For at opretholde rekombinationens specificitet genkender og binder V(D)J-rekombinase rekombinationssignalsekvenser (RSS’er), der flankerer de variable (V), diversitets (D) og sammenføjende (J) gensegmenter, og binder sig til disse. RSS’er består af tre elementer: en heptamer med syv bevarede nukleotider, en spacerregion med en længde på 12 eller 23 basepar og en nonamer med ni bevarede nukleotider. Selv om de fleste RSS’er varierer i sekvens, er konsensusheptamer- og nonamer-sekvenserne henholdsvis CACAGTG og ACAAAAACC, og selv om sekvensen af spacer-regionen er dårligt bevaret, er længden meget bevaret. Længden af spacerregionen svarer til ca. en (12 basepar) eller to omgange (23 basepar) af DNA-helixen. I henhold til den såkaldte 12/23-regel støder gensegmenter, der skal rekombineres, normalt op til RSS’er med forskellige spacerlængder (dvs. at det ene har en “12RSS” og det andet en “23RSS”). Dette er et vigtigt træk i reguleringen af V(D)J-rekombination.
ProcessEdit
V(D)J-rekombination begynder, når V(D)J-rekombinase (gennem RAG1’s aktivitet) binder en RSS, der flankerer et kodende gensegment (V, D eller J), og skaber et enkeltstrengs-nick i DNA’et mellem den første base i RSS’en (lige før heptameren) og det kodende segment. Dette er i det væsentlige energimæssigt neutralt (der er ikke behov for ATP-hydrolyse) og resulterer i dannelsen af en fri 3′-hydroxylgruppe og en 5′-fosfatgruppe på samme streng. Den reaktive hydroxylgruppe er placeret af rekombinasen således, at den angriber fosfodiesterbindingen på den modsatte streng, hvorved der dannes to DNA-ender: en hårnål (stam-loop) på kodningssegmentet og en stump ende på signalsegmentet. Den nuværende model er, at DNA-nikking og hairpin-dannelse sker på begge strenge samtidig (eller næsten) i et kompleks, der er kendt som et rekombinationscenter.
De stumpe signalender er flush-ligeret sammen for at danne et cirkulært stykke DNA, der indeholder alle de mellemliggende sekvenser mellem de kodningssegmenter, der er kendt som et signalled (selv om det er cirkulært af natur, skal det ikke forveksles med et plasmid). Selv om man oprindeligt troede, at de gik tabt under successive celledelinger, er der beviser for, at signalleddene kan genindtræde i genomet og føre til patologier ved at aktivere onkogener eller afbryde tumorsuppressor-genfunktion(er).
De kodende ender behandles yderligere før deres ligering ved flere begivenheder, der i sidste ende fører til junctional diversitet. Bearbejdningen begynder, når DNA-PK binder sig til hver brudt DNA-ende og rekrutterer flere andre proteiner, herunder Artemis, XRCC4, DNA-ligase IV, Cernunnos og flere DNA-polymeraser. DNA-PK danner et kompleks, der fører til dets autofosforylering, hvilket resulterer i aktivering af Artemis. De kodningsende hårnåle åbnes af Artemis’ aktivitet. Hvis de åbnes i midten, vil der opstå en stump DNA-ende; i mange tilfælde er åbningen imidlertid “excentrisk” og resulterer i, at der bliver ekstra baser tilbage på den ene streng (et overhæng). Disse er kendt som palindromiske (P) nukleotider på grund af den palindromiske karakter af den sekvens, der opstår, når DNA-reparationsenzymerne løser overhænget. Processen med artemis’ åbning af hårnåle er et afgørende trin i V(D)J-rekombination og er defekt i musemodellen med svær kombineret immundefekt (scid).
Dernæst tilpasser XRCC4, Cernunnos og DNA-PK DNA-enderne og rekrutterer terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT), en skabelonuafhængig DNA-polymerase, der tilføjer ikke-templaterede (N) nukleotider til den kodningsbærende ende. Tilføjelsen er for det meste tilfældig, men TdT udviser en præference for G/C-nukleotider. Som alle kendte DNA-polymeraser tilføjer TdT nukleotider til den ene streng i 5′- til 3′-retningen.
Sidst kan exonukleaser fjerne baser fra de kodende ender (herunder eventuelle P- eller N-nukleotider, der måtte være dannet). DNA-polymeraserne λ og μ indsætter derefter yderligere nukleotider efter behov for at gøre de to ender kompatible til sammenføjning. Dette er en stokastisk proces, og derfor kan der forekomme en hvilken som helst kombination af tilføjelse af P- og N-nukleotider og exonukleolytisk fjernelse (eller slet ingen). Til sidst bliver de forarbejdede kodningsender ligeret sammen af DNA-ligase IV.
Alle disse forarbejdningsbegivenheder resulterer i en paratop, der er meget variabel, selv når de samme gensegmenter rekombineres. V(D)J-rekombination gør det muligt at generere immunoglobuliner og T-cellereceptorer mod antigener, som hverken organismen eller dens forfader(e) behøver at have mødt tidligere, hvilket giver mulighed for et adaptivt immunrespons mod nye patogener, der udvikles, eller mod dem, der hyppigt ændres (f.eks. sæsonbestemt influenza). Et vigtigt forbehold ved denne proces er imidlertid, at DNA-sekvensen skal forblive inden for rammen for at bevare den korrekte aminosyresekvens i det endelige proteinprodukt. Hvis den resulterende sekvens er out-of-frame, vil cellens udvikling blive standset, og cellen vil ikke overleve til modenhed. V(D)J-rekombination er derfor en meget kostbar proces, som skal være (og er) strengt reguleret og kontrolleret.