Isolierung und Identifizierung von flüchtigen Stoffen
Die menschliche Nase nimmt viele flüchtige organische Verbindungen (VOC) als Gerüche wahr, und diese Gerüche sind oft unser erster Hinweis auf die Anwesenheit von Schimmelpilzen. Die chemische Charakterisierung (Isolierung, Trennung, Identifizierung und Quantifizierung) von flüchtigen organischen Verbindungen erfordert jedoch spezielle Analysemethoden, die sich von den in der traditionellen „Nass“-Chemie verwendeten Verfahren unterscheiden. Technologische Fortschritte im späten 20. und frühen 21. Jahrhundert haben unsere Fähigkeit verbessert, flüchtige Stoffe präzise, genau und in niedrigen Konzentrationen nachzuweisen (Zhang und Li, 2010; Hung et al., 2015). Zu den traditionellen Methoden gehören die Wasserdampfdestillation und die Flüssig-Flüssig-Extraktion, gefolgt von der Konzentration und der chemischen Überprüfung der einzelnen Verbindungen. Einige der frühesten Studien zur chemischen Natur von VOC wurden mit Methylenchloridextrakten durchgeführt, die durch Wasserdampfdestillation konzentriert und durch Gas-Flüssig-Chromatographie und Massenspektrometrie (MS) analysiert wurden. In einer frühen Studie wurden mit diesem Ansatz die VOC von Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae und Aspergillus parasiticus analysiert. Alle vier Arten produzierten 3-Methylbutanol, 3-Octanon, 3-Octanol, 1-Octen-3-ol, 1-Octenol und 2-Octen-1-ol. Bei A. niger bestand das identifizierte VOC-Gemisch zu über 90 % aus 1-Octen-3-ol, der Geruchsverbindung, die den Pilzen ihren charakteristischen Geruch verleiht. Bei A. parasiticus machte 1-Octen-3-ol 35,6 % des gesamten flüchtigen Gemischs aus, während die verwandte Acht-Kohlenstoff-Verbindung 2-Octen-1-ol, die einen unangenehmen muffig-öligen Geruch hat, 34,8 % ausmachte (Kamiński et al., 1974).
Methoden stützen sich seitdem auf die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), die chromatographische Trennung, Identifizierung durch Massenspektren und chromatographische Retention und Quantifizierung flüchtiger Proben kombiniert. VOCs im Kopfraum von Pilzkulturen werden in der Regel durch feste sorptive Materialien wie Aktivkohle oder Fasern aufgefangen. Jede Sammelmethode hat ihre eigenen Vorzüge und kann zur Bildung von Artefakten führen; im Allgemeinen werden unpolare Verbindungen gegenüber polaren bevorzugt gesammelt. Auch bei der Gaschromatographie können Fehler auftreten, da es manchmal schwierig ist, zwei Verbindungen voneinander zu trennen, was zu ihrer Vermischung führt. Dies wurde im Fall von 2-Methyl-1-butanol und 3-Methyl-1-butanol festgestellt, Isomere, die sich nur durch die Verschiebung einer Methylgruppe unterscheiden (Börjesson et al., 1992). Zu den weiteren Nachteilen der GC-MS-Analyse gehören der Bedarf an geschultem Personal, die relativen Kosten und die Tatsache, dass sie bei reaktionsfreudigeren VOCs nicht effektiv ist (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao und Martin, 2002; Rappert und Müller, 2005).
Die Festphasenmikroextraktion (SPME) ist eine beliebte und tragbare Methode. Die flüchtigen organischen Verbindungen werden zunächst auf einer Faser absorbiert und konzentriert und dann zum Detektor geleitet, wo die Desorption im GC-Injektor selbst stattfindet. SPME eignet sich gut für die Entnahme von Umweltproben, die dann zur Identifizierung ins Labor zurückgebracht werden. In Verbindung mit GC-MS ist sie ein bequemes und weit verbreitetes Mittel zur qualitativen Identifizierung von VOCs aus mikrobiellen Kulturen oder aus kontaminierten Gebäuden (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń und Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). SPME ist oft die beste Methode zur Bestimmung der relativen Menge einer flüchtigen Zielverbindung in einer Erkundungssituation oder für wiederholte Probenahmen. Für die Identifizierung neuartiger Verbindungen ist sie jedoch nicht geeignet.
Es wurden zahlreiche spezialisierte Analysemethoden entwickelt, die die klassischen GC-MS-Ansätze ergänzen und für gezielte Analysen nützlich sein können. Beispielsweise ist die Protonentransferreaktions-Massenspektrometrie (PTR-MS) nützlich für die schnelle Probenahme und den Nachweis niedriger Konzentrationen (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Diese Methode wurde in der Umweltwissenschaft, der Lebensmitteltechnologie und der medizinischen Diagnose eingesetzt (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Mit Hilfe der thermischen Desorption (TD)-Gaschromatographie/Massenspektroskopie wurde das Profil der flüchtigen Metaboliten von Aspergillus fumigatus in vitro charakterisiert, das eine charakteristische Signatur aufweist, die die Monoterpene Camphen, α- und β-Pinen und Limonen sowie die Sesquiterpenverbindungen α- und β-trans-Bergamoten enthält (Koo et al., 2014).
Die selektive Ionenflussröhren-Massenspektrometrie (SIFT-MS) ist in der Lage, mikrobielle VOCs in einem mäßig komplexen Gasgemisch schnell und empfindlich nachzuweisen. Sie ist in der Lage, VOCs in niedrigen Konzentrationen im Promillebereich zu erfassen und kann bestimmte Verbindungen im Promillebereich messen. Bei dieser Technik werden die gesamten VOCs in einem Durchflussrohr ionisiert, so dass keine chromatografische Trennung erforderlich ist (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). Die Methode wurde zur Quantifizierung von VOC eingesetzt, die von A. fumigatus in Kokultur mit Bakterien emittiert werden, die häufig in erkrankten menschlichen Lungen zu finden sind. Kulturen mit A. fumigatus produzierten „reichlich“ Ammoniak und die schwefelorganischen Verbindungen Methanthiol (auch bekannt als Methylmercaptan), Dimethylsulfid und Dimethyldisulfid (Chippendale et al., 2014).
Die Simultandestillationsextraktion (SDE) umfasst eine kurze Siliziumdioxidfaser, die mit organischem Material als stationäre Phase bedeckt ist, um VOCs zu konzentrieren, die dann in einem heißen Injektor desorbiert werden. Die SDE wurde zur Bestimmung flüchtiger Komponenten bei Umwelt-, Lebensmittel-, forensischen, Öl-, Pharma- und Polymeranalysen eingesetzt, um konzentriertere Proben zu erhalten (Orav et al., 1996). So wurden beispielsweise bestimmte Aromastoffe mit einer Kombination aus SDE und SPME untersucht. Aromastoffe können mit SDE quantitativ analysiert werden, während SPME für ein einfaches, schnelles und routinemäßiges Screening verwendet wird (Cai et al., 2001).
Das Multikapillar-Säulen-Ionenmobilitätsspektrometer (MCC-IMS) hat eine Empfindlichkeit bis in den Promillebereich, ist schnell und erfordert geringe technische Kenntnisse. Mit diesem Ansatz wurden charakteristische Metaboliten von A. fumigatus und Candida-Spezies in der Headspace-Analyse unterschieden (Perl et al., 2011).
Elektronische Nasen (E-Nasen) übersetzen flüchtige Stoffe in elektrische Signale, die auf der Interaktion mit elektronischen Oberflächen basieren, und können zum Nachweis bekannter Verbindungen verwendet werden. E-Nasen bestehen aus einer Gruppe chemischer Sensoren mit unterschiedlichen Selektivitäten, einer Signalvorverarbeitungseinheit und einem System zur Musterunterscheidung (Gardner und Bartlett, 1994). Verschiedene VOCs bilden einen charakteristischen Fingerabdruck, der durch Vergleiche mit zuvor aufgezeichneten Mustern im Erkennungssystem unterschieden werden kann. Die medizinische Anwendung von E-Noses konzentrierte sich ursprünglich auf bakterielle Krankheitserreger oder nichtinfektiöse Krankheiten wie Lungenkrebs, chronisch obstruktive Lungenerkrankung und Asthma (Valera et al., 2012). Je nach Anwendung werden VOC-Proben aus Abstrichen, Sputum, Serum, Fäkalien, Atem oder Urin für diagnostische Zwecke verwendet. Atemproben wurden für die Früherkennung von Aspergillose verwendet (de Heer et al., 2013).
Es gibt nach wie vor viele technische Herausforderungen bei der Arbeit mit Pilz-VOCs, und es ist oft schwierig, die Ergebnisse verschiedener Labors zu vergleichen. Dieselbe Pilzart kann aufgrund unbekannter oder unkontrollierter Umwelt- und genetischer Faktoren unterschiedliche VOC-Profile aufweisen. Außerdem kann das verwendete Versuchsprotokoll das VOC-Profil drastisch beeinflussen. Beispielsweise wiesen de Lucca et al. (2010) in ihrer Arbeit mit Aspergillus flavus nur ein Terpen nach, indem sie SPME zur Sammlung von flüchtigen Stoffen verwendeten, bevor sie diese der GC-MS unterzogen. Durch den späteren Einsatz eines Probenkonzentrators vor der Weiterleitung an ein anderes GC-MS-Gerätemodell war die Gruppe in der Lage, mehrere Terpene zu erkennen (de Lucca et al., 2012). Die Art der Handhabung der Materialien vor den Experimenten kann zu Artefakten führen, und das Autoklavieren kann die Bildung nichtbiogener flüchtiger Stoffe verursachen (Börjesson et al., 1992). Da die Daten in den verschiedenen Versuchen häufig nicht übereinstimmen, haben einige Autoren die Reproduzierbarkeit der mikrobiellen VOC-Emissionen in Frage gestellt (Schleibinger et al., 2002). Bei künftigen Arbeiten mit pilzlichen VOCs müssen die vielen Faktoren berücksichtigt werden, die die Ergebnisse beeinflussen können. Es wäre nützlich, wenn die Gemeinschaft der Wissenschaftler, die Pilz-VOCs untersuchen, Leitlinien für bewährte Verfahren entwickeln würde.