10x Genomics Blog

Schwimmen in einem Meer von Zellen: Warum Einzelzellgenomik?

Komplexe biologische Systeme ergeben sich aus der koordinierten Funktion einzelner Zellen, die einen komplizierten „Tanz“ aufführen, wobei jede Zelle ihre eigene spezielle Rolle zum Ensemble beiträgt. Aufgrund dieser Komplexität ist die Erforschung der Genexpression in Organismen, Geweben oder Zellpopulationen durch die Verwendung herkömmlicher Massen-RNA-Seq-Methoden oft eingeschränkt. Als Wissenschaftler verstehen wir intuitiv, dass wir, wenn wir Experimente mit unserer verdünnten RNA-Mischung durchführen, nur einen kleinen Eindruck davon bekommen, was in den Zellen, die uns interessieren, vor sich geht: Die Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden übersehen und die zelluläre Heterogenität kann völlig verdeckt werden. Tatsächlich beschreibt die Analyse der Massen-RNA-Expression oft einen Zustand, in dem keine (oder nur sehr wenige) der Zellen tatsächlich existieren!

Vielleicht arbeiten Sie als Neurowissenschaftler im Mäusegehirn und untersuchen die Entwicklung einer Unterpopulation von Neuronen, die einen bestimmten Neurotransmitter produzieren. Wenn Sie diese Population isolieren und Zelle für Zelle analysieren könnten, wären die möglichen Erkenntnisse in der Tat neuronal stimulierend! Ähnliches gilt für die Krebsforschung: Wie kann man die Genexpression und, was vielleicht noch wichtiger ist, die zelluläre Heterogenität in einem Tumor am besten aufschlüsseln? Was wäre, wenn man nicht nur die Unterschiede zwischen den Tumoren, sondern auch innerhalb des Tumors vergleichen und die mit der Mikroumgebung des Tumors verbundenen Immunzellpopulationen untersuchen könnte? Diese Vielfalt, die oft durch Massen-RNA-seq-Methoden verdeckt wird, kann durch die Verwendung von Einzelzell-RNA-seq aufgedeckt werden, um speziell diese klinisch wichtigen Zellpopulationen zu untersuchen. Die Beispiele für die Nachteile der Massenanalyse sind zahlreich, und die Analyse der Zelltypunterschiede in den meisten, wenn nicht allen, dieser komplexen biologischen Systeme ist entscheidend für unser Verständnis ihrer Beiträge, insbesondere während der Entwicklung und beim Fortschreiten der Krankheit.

Wie isolieren und analysieren wir einzelne Zellen?

Die Einzelzell-RNA-seq (scRNA-seq)-Technologie von 10x Genomics, die Chromium™ Single Cell 3′-Lösung, ermöglicht die Analyse von Transkriptomen auf der Basis einzelner Zellen durch mikrofluidische Partitionierung, um einzelne Zellen zu erfassen und barcodierte cDNA-Bibliotheken für die nächste Generation der Sequenzierung (NGS) vorzubereiten. Konkret werden einzelne Zellen, Reagenzien für die reverse Transkription (RT), Gel Beads mit barcodierten Oligonukleotiden und Öl auf einem mikrofluidischen Chip kombiniert, um Reaktionsbläschen zu bilden, die als Gel Beads in Emulsion (GEMs) bezeichnet werden. Die GEMs werden parallel in den mikrofluidischen Kanälen des Chips gebildet, so dass der Benutzer 100 bis 10.000 einzelne Zellen in einem einzigen 7-minütigen Chromium™-Instrumentenlauf verarbeiten kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die Zellen mit einer begrenzten Verdünnung geladen werden, um die Anzahl der GEMs, die eine einzelne Zelle enthalten, zu maximieren, um eine niedrige Dublettenrate zu gewährleisten und gleichzeitig eine hohe Zellwiederfindungsrate von bis zu 65 % beizubehalten.

Jedes funktionale GEM enthält eine einzelne Zelle, ein einzelnes Gel Bead und RT-Reagenzien. In jedem GEM-Reaktionsvesikel wird eine einzelne Zelle lysiert, das Gel Bead wird aufgelöst, um die identisch barcodierten RT-Oligonukleotide in die Lösung freizusetzen, und es erfolgt eine reverse Transkription der polyadenylierten mRNA. Das Ergebnis ist, dass alle cDNAs aus einer einzelnen Zelle denselben Barcode haben, so dass die Sequenzierungs-Reads auf ihre ursprüngliche einzelne Ursprungszelle zurückgeführt werden können. Die Vorbereitung von NGS-Bibliotheken aus diesen barcodierten cDNAs wird dann in einer hocheffizienten Massenreaktion durchgeführt. Das nachstehende Video erklärt anschaulich, wie dies alles funktioniert.

Von der Probenvorbereitung bis zu Anleitungsvideos: Hilfreiche Links für den Einstieg

Der Chromium Single Cell 3′-Workflow beginnt mit den Zellen, die Sie interessieren, gefolgt von der Erstellung der NGS-Bibliothek mit unseren Reagenzienkits und dem Chromium Controller. Die Vorbereitung Ihrer barcodierten cDNA-Bibliothek (wie im obigen Video allgemein beschrieben) ist ein wichtiger Schritt und getreu dem Sprichwort „garbage in, garbage out“ – die Vorbereitung qualitativ hochwertiger Zellsuspensionen ist der Schlüssel, um das Beste aus Ihren RNA-seq-Daten herauszuholen. Wenn Sie Unterstützung bei der Zellvorbereitung benötigen, finden Sie auf unserer Website mehrere Protokolle, wie z. B. die Dissoziation von Nervengewebe oder die Vorbereitung von Moosprotoplasten-Suspensionen für die Verwendung in der scRNA-seq, und auf unserer Support-Website werden regelmäßig weitere Protokolle hinzugefügt. Ein guter Ausgangspunkt für Anleitungen und Empfehlungen, wie Sie Ihre Proben am besten vorbereiten, sobald sie in Suspension sind, ist unser Leitfaden zur Vorbereitung von Einzelzellen, in dem Sie mehr über bewährte Verfahren erfahren und ein allgemeines Protokoll sehen können. Wenn Sie eher visuell lernen, helfen Ihnen unsere Anleitungsvideos, insbesondere die Kapitel 4 bis 7, bei der Proben- und Bibliotheksvorbereitung.

• Single Cell Prep Guide

• Demonstrated Protocols

• How-to-videos

• Chromium™ Controller

• Benutzerhandbücher

• AnleitungenVideos

• Cell Ranger™ Software

• Loupe™ Cell Browser

• Anleitungsvideos

Analysieren Sie Ihre Daten, eine Zelle nach der anderen

Nach der Vorbereitung Ihrer Bibliothek wird die Sequenzierung mit Illumina® Sequenzierungsgeräten durchgeführt. Jetzt kommt der spannende Teil: die Gewinnung biologischer Erkenntnisse aus Ihren Einzelzell-RNA-seq-Daten! Die (potenziell) riesigen Datenmengen, die Sie mit der Chromium Single Cell 3′-Lösung generieren, können problemlos mit unserer Software und unseren Visualisierungstools verarbeitet werden, die entwickelt wurden, um Ihnen einen Großteil des Rätselratens abzunehmen – die Cell Ranger™ Software wandelt die barcodierten Sequenzierungsdaten in Dateien um, die für die Einzelzellexpressionsanalyse bereit sind, und die Visualisierung erfolgt über den Loupe™ Cell Browser. Wenn Sie eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung unserer Software wünschen, finden Sie in den Kapiteln 8 bis 11 unserer Anleitungsvideos alles von der Transkriptionszählung mit der Cell Ranger Software bis zur wunderschönen Datenvisualisierung mit dem Loupe Cell Browser. Es gibt auch eine wachsende Zahl von Einzelzellanalysetools, die von der Community entwickelt wurden, darunter Seurat, Monocle und Cell View. Lesen Sie mehr über diese Analysetools und andere Artikel über Einzelzellen im 10x Genomics Blog, in dem wir wichtige Forschungsbeiträge hervorheben, Tipps und Tricks bereitstellen und Sie über alles, was mit Einzelzellen zu tun hat, auf dem Laufenden halten!

Wenn Sie weitere Fragen oder Bedenken zum Einstieg in die Chromium Single Cell 3′-Lösung haben, können Sie hier einen Kommentar hinterlassen oder uns direkt kontaktieren. Ob Sie nun die Entwicklung von Hirnorganoiden verfolgen, die Knochenmarktransplantation bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie untersuchen oder einen neuartigen Weg zur Selbsterneuerung von Darmstammzellen entschlüsseln, die Zahl der Veröffentlichungen von Chromium Single Cell wächst täglich, und wir freuen uns darauf, von all Ihren erstaunlichen Forschungsergebnissen zu hören!