18O-Markierung: ein Werkzeug für die Proteomik

Es wird eine Bewertung der proteolytischen Markierung und Quantifizierung von Proteinen für diagnostische Zwecke unter Verwendung von Trypsin und mit 18O angereichertem H2O vorgestellt. Wir zeigen, dass eine vergleichende oder relative Quantifizierung mit diesem Ansatz effektiv durchgeführt werden kann. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Konservierung der markierten Peptide in Wasser in natürlicher Fülle ermöglicht, ohne dass ein Rückaustausch zu befürchten ist, vorausgesetzt, der pH-Wert ist ausreichend niedrig, um die katalytische Aktivität von Trypsin zu unterdrücken, aber nicht so niedrig, dass ein chemischer Rückaustausch gefördert wird. Da die Markierungseffizienz von der Beschaffenheit des Peptids abhängt, gibt es keine einfache lineare Beziehung zwischen dem relativen 16O/18O-Gehalt der Verdauungspuffermischung (x) und der Markierungseffizienz (y), sondern eine auf der Wahrscheinlichkeit basierende y = x(2) Beziehung. Daher kann das Ausmaß der Peptidmarkierung bei Verwendung von 16O/18O-Verdauungspuffermischungsverhältnissen erheblich von dem auf der Grundlage einer linearen Beziehung erwarteten Wert abweichen. Die Auswertung der relativen Ziptip-Effizienz zeigte einen Verlust der Probenausbeute, wenn die Peptidkonzentration unter normalen Bedingungen verringert wurde, was darauf hindeutet, dass es eine Grenze gibt, unterhalb derer die Ausbeute abnimmt. Darüber hinaus zeigten die Adsorptionsverluste aufgrund von Speedvac-Trocknung und -Wiedergewinnung bescheidene Verluste (20 %), die von Peptid zu Peptid stark variieren können (0-50 %). Die Effizienz des Aufschlusses in Lösung von Standardproteinmischungen als Funktion der Konzentration zeigte eine lineare Abnahme mit abnehmender Konzentration. Dies steht im Einklang mit enzymkinetischen Effekten und weist auf einen potenziellen Quantifizierungsfehler hin, der bei der Bewertung der differentiellen Expression auf der Grundlage des Peptidnachweises auftreten kann. Die Ergebnisse unserer Studien zeigen die Leistungsfähigkeit der 18O-Markierung als Optimierungsinstrument für die Entwicklung von Proteomikprozessen.