Analyse und Quantifizierung der In-vitro-Myoblastenfusion mit dem LADD Multiple Stain

Erwachsenes Skelettmuskelgewebe enthält eine Population von Vorläuferzellen, die als Satellitenzellen bekannt sind und für die Reparatur der Skelettmuskulatur verantwortlich sind (1-3). Aktivierte Satellitenzellen (Myoblasten) wandern zum Ort des Muskeltraumas, wo sie proliferieren, sich differenzieren und zu mehrkernigen Myotubes fusionieren (3-5). Der letztendliche Erfolg dieses Prozesses wird daran gemessen, inwieweit die ansässigen Myoblasten während der terminalen Differenzierung fusioniert haben.

Um die Myoblastenfusion in vitro experimentell zu bewerten, wird ein Fusionsindex berechnet, der auf dem Nachweis der Immunfluoreszenz durch Mikroskopie beruht. Fluoreszenzmarkierte Antikörper werden zum Nachweis von Muskelfaser-Strukturproteinen wie Myosin Heavy Chain (MyHC) und Desmin verwendet, oder alternativ kann fluoreszenzmarkiertes Phalloidin zur Visualisierung von F-Actin eingesetzt werden (6-9). Die Zellkerne werden mit einer DNA-bindenden Verbindung wie Hoechst 33258 fluoreszierend markiert. Anschließend wird entweder der prozentuale Anteil der Kerne in Myozyten mit ≤3 Kernen (9) oder der prozentuale Anteil der Kerne in MyHC-positiven Myotubes (10) berechnet. Diese Ansätze sind gut etabliert; sie erfordern jedoch eine umfangreiche, zeitaufwändige Optimierung, um ein starkes und spezifisches Signal für das gewünschte Antigen zu erzeugen, und eine anschließende Fusionsanalyse. Wenn fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet werden, ist der Zugang zu einem Fluoreszenzmikroskop eine zusätzliche Voraussetzung, die nicht in allen Einrichtungen gegeben ist. Die anschließende Quantifizierung erfordert eine mühsame und zeitaufwändige Analyse zahlreicher Bildfelder, um einen für die Population repräsentativen Fusionsindex zu erhalten. Diese Einschränkungen sowie die relativen Kosten von Antikörper-basierten Assays haben uns dazu veranlasst, einen schnellen, kostengünstigen In-vitro-Assay zur Quantifizierung der Myoblastenfusion unter Verwendung des weithin erhältlichen LADD Multiple Stain zu entwickeln.

Der LADD Multiple Stain (11) ist ein kombinierter Kern- und Zytoplasma-Farbstoff, der Fuchsin und Toluidinblau enthält (Kat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Für unsere Untersuchungen wird frisches LADD zubereitet, das 0,365 g Toluidinblau (Kat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) und 0,135 g Fuchsin (Kat. #47860-25G; Sigma-Aldrich) in einem Endvolumen von 50 ml 30%igem Ethanol enthält. Die Lösung wird gemischt, bis sie aufgelöst ist, und dann durch Whatman-Filterpapier (Nr. 4) (Kat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) filtriert. Die LADD-Färbung kann in einem Kunststoff- oder Glasbehälter bei Raumtemperatur aufbewahrt und wiederverwendet werden. Die zu färbenden Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und 10 Minuten lang in 70 %igem Ethanol fixiert. Das Ethanol wird entfernt, und 500 µL LADD-Färbemittel werden zugegeben, um die Zellen vollständig zu bedecken. Die Zellen werden 1 Minute lang inkubiert, dann wird der Farbstoff entfernt und die Zellen werden wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das LADD nicht mehr in das Wasser übergeht. Die Zellen werden dann getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert, bis sie mit Hilfe der Phasenkontrast-Lichtmikroskopie untersucht werden. Um die Beleuchtung während der Betrachtung zu verbessern, können die gefärbten Zellen in PBS getaucht werden.

Um festzustellen, ob diese Färbung erfolgreich zur Visualisierung der Myoblastenfusion eingesetzt werden kann, wurden C2C12-Zellen unter Standard-Kulturbedingungen (12) auf 80 % Konfluenz (Abbildung 1A) gezüchtet. Dann wurde das Medium durch ein Differenzierungsmedium mit 2 % Pferdeserum ersetzt, was zur Fusion zu Myotubes führte (Abbildung 1B). Die erfolgreiche Differenzierung wurde durch eine erhöhte Expression von MyHC (Abbildung 1D) im Vergleich zu undifferenzierten Zellen bestätigt (Abbildung 1C). Nach der LADD-Färbung zeigen die undifferenzierten C2C12-Myoblasten ein hellviolettes Zytoplasma und einen dunkleren Zellkern (Abbildung 1E; Pfeil). Nach der Differenzierung erscheint das Zytoplasma der Myotube jedoch dunkelviolett (Abbildung 1F; Pfeilspitzen), während hellere Kerne innerhalb der vielkernigen Zelle deutlich sichtbar sind (Abbildung 1F; Pfeil). Daher sind nach der LADD-Mehrfachfärbung klar definierte Zellkerne zu beobachten, die sich ebenso leicht vom Zytoplasma der mehrkernigen Myotube unterscheiden (Abbildung 1F), wie bei der Fluoreszenzmikroskopie nach der Immunzytochemie (Abbildung 1D).

Um festzustellen, ob die Bildanalyse zur Messung des Fortschritts der Myoblastenfusion verwendet werden kann, wurden C2C12-Zellen 6 Tage lang differenziert und Bilder von LADD-gefärbten Zellen bei 200-facher Vergrößerung mit einem Olympus CKX41-Inverslichtmikroskop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) aufgenommen. Wie erwartet, nahm die Zahl der fusionierenden Myozyten und Myotuben an jedem weiteren Differenzierungstag deutlich zu (Abbildung 2A). Anschließend wurde ein Fusionsindex berechnet, und es zeigte sich, dass der Fusionsindex der differenzierten Myoblasten schrittweise von 0,45 % (Tag 1) auf 31,4 % (Tag 6) anstieg (Abbildung 2B). Der auf diese Weise ermittelte Fusionsindex lässt sich gut mit dem Index vergleichen, der mithilfe von Standard-Immunzytochemie (zum Nachweis von MyHC) und Kernfärbung berechnet wurde (13). Um festzustellen, ob die Analysesoftware ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) zur Quantifizierung der Myofaserfläche (als Maß für die Fusion) angepasst werden kann, wurde ein Makro entwickelt und an den in Abbildung 2A dargestellten Bildern getestet. Das Makro wird wie folgt eingerichtet und dann gespeichert:

• Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf „Plugins = > Macros = > Startup Macros“

• Ersetzen Sie den vorhandenen Text durch die in der ergänzenden Tabelle S1 gezeigte Kodierung.

Die Bilder werden in ImageJ geöffnet, und das Makro wird durch Klicken auf „Macros = > Run Macro“ ausgeführt. Dabei werden die Bilder nacheinander analysiert. Der Benutzer muss sich vergewissern, dass der Schwellenwert richtig eingestellt ist; es sollte nur der Myofaserbereich analysiert werden. Der Farbschwellenwert kann durch Bearbeiten der Makrozeile „setThreshold(0,130)“ geändert werden; durch Erhöhen der zweiten Zahl werden mehr leicht gefärbte Bereiche einbezogen, während mehr Bereiche ausgeschlossen werden, wenn diese Zahl verringert wird. Mit dieser Methode erreichte die Myofaserfläche an Tag 6 29,6 % (Abbildung 2C), was gut mit dem für denselben Zeitpunkt berechneten Fusionsindex (Abbildung 2B) übereinstimmt. Jenner- und Giemsa-Farbstoffe können auch verwendet werden, um Myotubes für die Lichtmikroskopie in ähnlicher Weise wie LADD zu färben, jedoch ist die Färbung mit LADD um ein Vielfaches schneller, und das von uns entwickelte ImageJ-Makro ermöglicht eine bessere Kontrolle darüber, welche Bereiche gemessen werden (14).

Um die Verwendung des LADD Multiple Stain für die Fusionsanalyse weiter zu validieren, wurden C2C12-Zellen 5 Tage lang in An- oder Abwesenheit von 10 µM BB94 (Kat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) differenziert und anschließend wie zuvor beschrieben fixiert und mit LADD gefärbt. BB94 ist ein im Handel erhältlicher synthetischer Matrix-Metalloprotease-Inhibitor, der nachweislich die Myoblastenfusion reduziert (15,16). In Anwesenheit von BB94 verringerte sich der Fusionsindex signifikant von 50 % (DMSO-Kontrolle) auf 22 % (P < 0,05) (Abbildung 2D); die Analyse der Myofaserfläche ergab den gleichen Trend, wobei die Fusion von 46 % (DMSO-Kontrolle) auf 21 % (P < 0.05) in Anwesenheit von BB94 (Abbildung 2E).

Hier präsentieren wir eine schnelle, neuartige Methode zur Färbung sowohl der Myofaserstruktur als auch der zugehörigen Myonuklei unter Verwendung des LADD Multiple Stain. Anschließend wird ImageJ verwendet, um die Muskelfaserfläche als Maß für die Verschmelzung genau zu bewerten. Die relativ geringen Kosten von LADD und die stark reduzierte Zeit, die für die Verarbeitung und Analyse benötigt wird, bedeuten, dass die Fusion jetzt in einem Standardlabor schnell analysiert werden kann, ohne dass Immunozytochemie und Fluoreszenzmikroskopie erforderlich sind.