Axiale Auflösung

1.43.2 Der Fall für superauflösende Mikroskopietechniken

Seitliche und axiale Auflösungen im Lichtmikroskop sind grundsätzlich beugungsbegrenzt durch das Verhältnis zwischen der Wellenlänge des Lichts und der Öffnung oder dem Akzeptanzwinkel des für die Abbildung verwendeten Objektivs, wie von Ernst Abbe 1873 beschrieben. In der lateralen Dimension liegt diese Auflösungsgrenze bei etwa 200 nm und in der axialen Dimension bei etwa 500 nm. Die Beugungsgrenze der optischen Mikroskopie ergibt sich aus den grundlegenden Beschränkungen der bei der Bilderzeugung verwendeten Optiken. Betrachtet man das Bild, das von einer sphärischen Lichtquelle mit geringer Auflösung erzeugt wird, so stellt man fest, dass das Bild, das selbst bei einer perfekt korrigierten, aberrationsfreien Mikroskopoptik entsteht, nicht durch eine einfache Kugel beschrieben wird. Vielmehr wird eine komplexe 3D-Intensitätsverteilung im Brennpunkt beobachtet, und diese 3D-Intensitätsverteilung kann mathematisch durch die Punktspreizungsfunktion (PSF) beschrieben werden (Abbildung 1). Das zentrale Maximum der PSF enthält 86,5 % der gesamten verfügbaren Energieintensität. Sowohl in der lateralen als auch in der axialen Dimension wird die verbleibende Energieintensität in einer Reihe von Maxima und Minima rotationssymmetrisch abgebildet. Es ist die Interaktion der PSFs benachbarter Bildmerkmale, die letztlich die Beugungsauflösungsgrenze des Lichtmikroskops bestimmt.

Abbildung 1. XY (a) und XZ (b) Intensitätskarten einer idealen Punktspreizungsfunktion.

Wenn sich zwei Objekte im Raum einander nähern, überlappen sich ihre PSFs, und bald können die beiden Objekte nicht mehr voneinander unterschieden werden. Die minimale Überlappung zweier PSFs, die toleriert werden kann, bevor die beiden Objekte nicht mehr voneinander unterschieden werden können, wurde als der Punkt beschrieben, an dem die Intensität zwischen den beiden PSFs um etwa 25 % abnimmt. Der Punkt, an dem dieser Intensitätsabfall erreicht wird, entspricht dem Abstand zwischen dem zentralen Maximum und dem ersten Minimum der PSF. Es ist sehr schwierig, diesen Abstand genau zu bestimmen, da es schwierig ist, das Minimum genau zu positionieren, und stattdessen wird die Halbwertsbreite (FWHM) des zentralen Maximums der PSF verwendet.

aus beiden Gleichungen geht hervor, dass laterale und axiale Auflösungen von der numerischen Apertur des optischen Systems, das das Licht sammelt, und der Wellenlänge des Lichts selbst abhängen. Ein besseres Auflösungsvermögen ergibt sich aus der Verwendung von Objektiven mit großer numerischer Apertur und kürzeren Wellenlängen des Lichts. Andere Faktoren wie die relative Helligkeit der beiden Objekte (Kontrast) beeinflussen diese minimale auflösbare Entfernung. In der Praxis sind bei der mikroskopischen Bildgebung sowohl eine ausreichende optische numerische Apertur als auch ein ausreichender Kontrast erforderlich, um subzelluläre Details genau betrachten zu können.

Wenn man die Beleuchtungswellenlänge in den ultravioletten Bereich verringert, um die Auflösung zu verbessern, wird die Auswahl an Fluoreszenzsonden eingeschränkt, und man stößt an die Grenzen der optischen Korrekturen und der Übertragungseigenschaften des optischen Weges des Mikroskops. Weitere Komplikationen ergeben sich aus der Verwendung ultravioletter Beleuchtung bei Untersuchungen an lebenden Zellen, bei denen viele Forscher die schädlichen Auswirkungen dieser Wellenlängen auf die langfristige Lebensfähigkeit von Zellen festgestellt haben. Moderne optische Konstruktionen haben die numerische Apertur von Objektiven verbessert, obwohl eine wirkliche Verbesserung in dieser Hinsicht nur durch die Verwendung von exotischen Trägermaterialien und Deckgläsern erreicht wurde. Beide Strategien führen nur zu einer bescheidenen Verbesserung der Auflösung und sind für Studien an lebenden Zellen unpraktisch.

Die biologische konfokale Mikroskopie, die eine Lochblende verwendet, um den Kontrast im Fokus durch die wirksame Entfernung von Streulicht aus unscharfen Objektebenen zu verbessern, ist zu einem Standardwerkzeug für die Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen in Zellen geworden. Durch die verbesserte Visualisierung der unscharfen Bildebene lassen sich die praktischen Beugungsgrenzen der Auflösung leichter erreichen, wenn das Instrument kritisch eingestellt ist. Theoretisch verbessert sich die laterale und axiale Auflösung bei einer Lochblende von weniger als 1 Airy-Einheit auf das 1,4-fache der Auflösung eines Weitfeldmikroskops. In der Praxis jedoch liefern Lochblenden mit einem Durchmesser von weniger als 1 Airy-Einheit zu wenig Licht für die biologische Bildgebung, da ein Großteil der fokussierten Emission zusammen mit dem unerwünschten unscharfen Licht von der Lochblende zurückgeworfen wird. Für die biologische Bildgebung, bei der man in der Regel darum kämpft, das Emissionssignal zu erhalten, ist die Zurückweisung eines Teils dieses begrenzten Signals für einen kleinen Auflösungsgewinn unpraktisch. Wenn das Emissionssignal der Probe begrenzt ist, entscheidet man sich in der Regel dafür, die Lochblende auf einen Durchmesser von mehr als 1 Airy-Einheit zu öffnen, um mehr Signale auf Kosten einer größeren optischen Schichtdicke zu sammeln. Bei diesen Lochblenden-Durchmessern ist die Auflösung des konfokalen Mikroskops im Wesentlichen dieselbe wie die eines herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops.

Das bedeutet nicht, dass man keine Objekte erkennen kann, die kleiner als die Auflösungsgrenze sind – der Nachweis ist sogar auf der Ebene einzelner Moleküle möglich und mit modernen Detektortechnologien relativ einfach. Durch den vollständigen Wegfall der direkten Beleuchtung, die bei der Dunkelfeldmikroskopie in das Objektiv eintritt, wird ein hervorragender Kontrast erzeugt, so dass selbst die geringe Lichtmenge, die von beugungsbegrenzten Objekten wie Mikrotubuli (25 nm Durchmesser) gestreut wird, leicht beobachtet werden kann. Die Fluoreszenzmikroskopie bietet ebenfalls hervorragende Kontrastbedingungen, die die Beobachtung und Aufzeichnung von Objekten ermöglichen, deren Abmessungen weit unterhalb der Beugungsgrenze liegen. Bei der Fluoreszenzmikroskopie mit totaler interner Reflexion (TIRF) wird der Kontrast gegenüber der Standard-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verbessert, indem die axiale Anregung auf einige hundert Nanometer der Flüssigkeits-Deckglas-Grenzfläche begrenzt wird, indem die evaneszente, feldnahe Lichtenergie zur Fluorophoranregung genutzt wird. Unter diesen Bedingungen kann sogar die Mobilität von Einzelmolekülen in einem sehr dünnen optischen Schnitt über die Zeit verfolgt werden. Weder die Dunkelfeld- noch die TIRF-Mikroskopie verbessern jedoch die Auflösung des optischen Systems – beide Techniken sind auf große Kontrastunterschiede zwischen dem interessierenden Objekt und dem Hintergrund angewiesen, um eine Detektion mit geringer Auflösung zu ermöglichen.

Die Überwindung der klassischen Beugungsauflösungsgrenzen war eine große Herausforderung in der modernen Lichtmikroskopie. Die Vorteile, die sich aus der Verbesserung unserer Fähigkeit ergeben, feinere Details mit dem Lichtmikroskop aufzulösen, sind offensichtlich. Eine höhere Auflösung würde eine genauere strukturelle Beschreibung molekularer Organisationen ermöglichen, die für die normale und abnormale Zellphysiologie und das Zellverhalten grundlegend sind. Molekulare und biochemische Sektionen reichen nur bedingt aus, um die Komplexität funktioneller Organisationen, wie sie an Adhäsionsfokuskontakten zu finden sind, aufzudecken. Die direkte Visualisierung dieser funktionellen Organisationen mit einer Auflösung, die sich der molekularen Dimension annähert, würde unser Verständnis der molekularen Zusammenhänge und der Veränderungen in der Organisation im Zusammenhang mit funktionellen oder physiologischen Zuständen erheblich verbessern. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Forschern verschiedene Strategien angewandt, um die klassischen lateralen und axialen Auflösungsgrenzen erheblich (2- bis 10-fach oder besser) zu verbessern. Diese Techniken lassen sich in zwei allgemeine Kategorien einteilen: solche, die sich auf Veränderungen in der Beleuchtung der Probe stützen, und solche, die Einzelmoleküldetektionsstrategien zusammen mit der Zeitdimension verwenden, um ein superaufgelöstes Bild zu erstellen.

Für diesen Artikel wurden die Techniken ausgewählt, die zur Entwicklung und Einführung kommerzieller Instrumente durch mehrere Hersteller geführt haben. Die Anwendung dieses spezifischen Kriteriums bei der Auswahl der nachstehend besprochenen Methoden ist in keiner Weise als Befürwortung dieser Techniken gegenüber anderen, die in der Literatur vorgestellt wurden, zu verstehen. Im Zuge der weiteren Entwicklung auf diesem sich rasch verändernden Gebiet kann es sein, dass neue Methoden und Ansätze die hier beschriebenen überholen. Die Einführung dieser kommerziellen Geräte auf dem Markt ermöglicht es jedoch einem breiten Spektrum von Biologen aus verschiedenen Disziplinen, Superauflösungsmethoden auf ihre eigenen spezifischen biologischen Fragen anzuwenden, wodurch diese Methoden aus den spezialisierten Entwicklungslabors herausgenommen werden. Die Leser werden ermutigt, sich selbst ein Bild von der hohen Qualität der Bilder zu machen, die im Online-Zusatzmaterial zu vielen der erwähnten Artikel enthalten sind.