Bakterienisolierung

Einführung

Es gibt etwa 10.000 benannte Arten von Mikroben. Man schätzt, dass auf jede identifizierte Art zwischen 10.000 und 100.000 weitere unidentifizierte Arten kommen. Es gibt nicht nur viele Arten von Bakterien, sondern auch sehr viele einzelne Bakterien. Ein einziger Löffel Erde kann 100 Millionen einzelne Bakterien enthalten. Wenn Sie Ihr Zahnfleisch abkratzen, können Sie 1 Million Bakterien pro cm2 finden (ein cm2 ist etwa so groß wie Ihr kleiner Fingernagel). Die Bakterien in und auf unserem Körper machen etwa 10 % unseres Trockengewichts aus.

Die meisten der derzeit bekannten Bakterienarten wurden mit Hilfe traditioneller mikrobiologischer Verfahren wie der Gram-Färbereaktion, Morphologie und Stoffwechselreaktionen identifiziert. Bakterien leben selten allein, sondern in Gemeinschaften mit anderen Bakterien. Dies gilt sowohl für die Umwelt als auch für unseren Körper und seine Umgebung. Dieser Kurs konzentriert sich auf die Rolle von Bakterien bei Krankheiten. Die Isolierung einer einzelnen Bakterienart ist der erste Schritt zur Identifizierung der Bakterien, die möglicherweise für einen Krankheitsprozess verantwortlich sind.

Die erste Voraussetzung für die physische Isolierung einer Bakterie ist, dass sie im Labor kultiviert werden kann. Dies erfordert die Kenntnis der optimalen Temperatur für das Wachstum, des optimalen Sauerstoffbedarfs und des optimalen Nährstoffbedarfs. Wir arbeiten in diesem Kurs mit einer sehr begrenzten Anzahl von Bakterien. Die Bakterien, mit denen wir arbeiten, sind auch sehr einfach im Labor zu züchten. Die meisten Bakterien sind nicht so angenehm zu kultivieren!

Es gibt zwei Hauptmethoden, um Organismen zu isolieren.

1. Aufschütteln für die Isolierung auf einer Agarplatte
2. Die Schüttplattenmethode

Das Aufschütteln für die Isolierung auf einer Agarplatte beinhaltet die sukzessive Verdünnung der Organismen, bis die Zellen eine so geringe Dichte haben, dass einzelne Zellen räumlich isoliert werden können, um erkennbare individuelle Kolonien zu bilden. Bei der Gießplattenmethode verdünnen Sie Ihre Probe ausreichend, bevor Sie sie in geschmolzenen, gekühlten Agar geben und diese Mischung dann in eine Schale gießen. Aus den isolierten Zellen bilden sich einzelne Kolonien, die im Agar selbst wachsen. Diese Technik kann ein wenig knifflig sein. Wenn der geschmolzene Agar zu heiß ist, werden alle Bakterien getötet. Wenn der geschmolzene Agar zu kalt ist, entsteht ein großer Klumpen in der Petrischale. Bei der Streumethode bilden sich einzelne Kolonien auf der Agaroberfläche. Diese Technik ist viel schneller und einfacher zu beherrschen.

Übersicht

Du bekommst eine Brüheprobe, die drei Organismen enthält, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens und Escherichia coli.

Alle drei Organismen wachsen leicht aerob auf tryptischem Soja-Agar (TSA). S. marsescens bildet jedoch nur bei 35°C oder weniger und optimal bei Raumtemperatur (25°C) ein rotes Pigment. Er wächst bei allen Temperaturen sehr schnell und bildet mittelgroße Kolonien.

E. coli hat bei allen Temperaturen ein hellbraunes Aussehen und wächst ebenfalls schnell und bildet große Kolonien.

S. xylosus hat bei allen Temperaturen ein gelb-orangefarbenes Aussehen, wächst schnell und bildet mittelgroße bis große Kolonien.

Dass Sie die drei Organismen auf Ihrer Platte isolieren und erkennen können, hängt von den richtigen Inkubationsbedingungen ab. Deine Platten werden 48 Stunden lang bei Raumtemperatur bebrütet. Sie sollten in der Lage sein, die drei Organismen anhand der Koloniegröße und des Pigments zu identifizieren.

Materialien

• 1 Mischkultur in einem TSB-Röhrchen mit Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens und Escherichia. Coli (alle BSL2)
• 3 TSA-Platten

Ausstreuen zur Isolierung

Es gibt mehrere Methoden des Ausstreuens zur Isolierung. Die überwiegende Mehrheit unserer Studenten ist mit der Quadrantenmethode am erfolgreichsten, die im Folgenden beschrieben wird.

1. Beschriften Sie Ihre Platte mit Ihrem Namen, Datum, Abschnitt und Organismus.
2. Verwenden Sie BSL2-Verfahren, um eine Schleife voller Organismen aus Ihrem TSB-Röhrchen zu gewinnen. Beziehen Sie sich auf das Protokoll zur aseptischen Technik.
   • Stellen Sie sicher, dass Sie Ihr Brühe-Röhrchen ausreichend gemischt haben, so dass die Organismen gleichmäßig in der Brühe suspendiert sind.
3. Füllen Sie Ihr TSB-Röhrchen wieder auf.
4. Sie können den nächsten Teil mit Ihrer Platte auf dem Labortisch durchführen oder sie in der Hand halten. Du entscheidest, was am besten funktioniert. Ziehen Sie Ihre Schleife leicht über die Agaroberfläche hin und her. (Siehe Abbildung 1.)
   • Je stärker du ziehst, desto mehr Bakterien setzt du ab.
   • Die allgemeine Idee ist, die Bakterienkonzentration mit jedem Zug zu verringern.
   • Vier bis fünf Zickzacklinien scheinen gut zu funktionieren.
   • Experimentiere mit deinen verschiedenen Platten. Achten Sie darauf, was Sie auf jeder Platte gemacht haben.
5. Wenn Sie einen Verbrennungsofen verwenden, sterilisieren Sie Ihre Schleife. Wenn Sie Kunststoffschleifen verwenden, werfen Sie Ihre gebrauchte Schleife in den Kavizidbehälter und besorgen Sie sich eine neue sterile Kunststoffschleife.
6. Gehen Sie nicht zurück in das ursprüngliche Brühe-Röhrchen.
7. Berühren Sie mit Ihrer Schleife die Agaroberfläche am anderen Ende Ihres ersten Streifens. Wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie hin und her ziehen.
   • o Ziehen Sie nicht in die Mitte der Platte.
   • o Sie sollten in der Lage sein, die schwachen Vertiefungen Ihrer Streifenlinie auf der Agaroberfläche zu sehen.
8. Verwenden Sie eine sterile Schleife und wiederholen Sie den Vorgang für Ihren zweiten Streifen.
9. Verwenden Sie eine sterile Schleife und wiederholen Sie den Vorgang für Ihren dritten Streifen. Zickzack den letzten Teil in die Mitte der Platte.
   • Sie sollten isolierte Kolonien irgendwo in Ihrem letzten Streifen finden.
10. Wenn Sie einen Verbrennungsofen verwenden, sterilisieren Sie Ihre Schleife. Wenn Sie Kunststoffschleifen verwenden, werfen Sie die gebrauchte Schleife in den Kavizidbehälter.
11. Setzen Sie den Deckel wieder auf Ihre Platte.
12. Legen Sie die fertigen Platten mit der Agarseite nach oben auf das Inkubationsgestell auf dem vorderen Tisch im Inkubationsbereich.

Abbildung 1: Quadrantenmethode für die Isolierung.

Hinweise

• Es ist unbedingt erforderlich, dass Sie Ihre Schleife zwischen den einzelnen Durchläufen sterilisieren, indem Sie entweder den Verbrennungsofen benutzen oder sich eine neue sterile Plastikschleife besorgen. Dies ist der häufigste Fehler, den Studenten machen.
• Lassen Sie Ihre Platte nicht zu lange offen, sonst fallen zusätzliche Bakterien aus der Umgebung in Ihre Platte.
• Sind Sie nicht enttäuscht, wenn Sie nicht gleich beim ersten Versuch isolierte Kolonien erhalten. Dies ist ein schwieriges Verfahren.