Identifizierung, Charakterisierung und Verifizierung der Proteine 130 und 131 als 14-3-3
Abbildung 1.
Abbildung 1. Bereiche der mit Silber gefärbten Gele, die die Proteinspots 130 und 131 nach zweidimensionaler Elektrophorese zeigen.
Feld A zeigt normalen Liquor, ohne die Spots 130 und 131. Tafel B zeigt Liquor von einem Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit; die Pfeile zeigen auf die Spots 130 und 131. Die Gele in den Feldern C und D stammen von einem Extrakt aus normalem menschlichen Gehirn. Die Felder A, B und C zeigen dieselbe Gelregion mit isoelektrischen Punkten zwischen 4,8 und 6,0 (von links nach rechts) auf der x-Achse und Größen zwischen 10 und 40 kd (von unten nach oben) auf der y-Achse. Der gestrichelte Kasten in Feld C umreißt den in Feld D gezeigten Bereich eines Gels mit einem pH-Bereich von 4,5 bis 5,4. Die Pfeile in den Feldern B und C zeigen die Lage der Spots 130 und 131, die in Feld D markiert sind.
Die Ergebnisse der zweidimensionalen Elektrophorese zum Nachweis der Liquorproteine 130 und 131 bei Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit sind in Abbildung 1A und Abbildung 1B dargestellt. Jüngste technische Verbesserungen haben zu einer höheren Auflösung geführt, mit sechs Spots anstelle der ursprünglich beschriebenen zwei (entsprechend den Proteinen 130 und 131). Um eine ergiebige Quelle für diese Proteine zu finden, untersuchten wir normales Hirngewebe, um festzustellen, ob sich in der Nähe der Konstellation von Spots, die den Liquorproteinen 130 und 131 entsprechen, irgendwelche Hirnproteine befinden. Abbildung 1C zeigt einen Ausschnitt aus einem silbergefärbten Gel nach zweidimensionaler Elektrophorese normaler Hirnproteine. Mehrere der Proteine erscheinen in demselben Bereich wie die 130-131-Konstellation, darunter zwei, die dieselbe Ladung und Masse wie die 130-131-Konstellation im Liquor haben. Die Identifizierung der beiden Spots auf der Grundlage ihrer Position wurde durch Komigrationsstudien bestätigt. Spot 130 wurde durch zweidimensionale Elektrophorese im engen Bereich (pH-Bereich, 4,5 bis 5,4) gereinigt, wie in Abbildung 1D dargestellt.
Spot 130 wurde aus 10 Blots herausgeschnitten, enzymatisch verdaut und mikrosequenziert. Die Aminosäuresequenzen wurden von vier Peptidfragmenten erhalten. Drei dieser Sequenzen, Val-Thr-Glu-Leu-Asn-Glu-Pro-Leu-Xaa-Asn-Glu-Asp-Xaa-Asn-Leu-Leu-Ser-Val-Ala, Asp-Tyr-Tyr-Xaa-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Gly-Glu-Lys und Asn-Val-Val-Xaa-Ala-Arg-Arg-Ser-Ser-Xaa-Arg-Val-Ile-Ser-Ser-Ile-Glu-Gln, stimmten mit der Sequenz des menschlichen 14-3-3-Proteins, Isoform eta, überein. Die vierte Sequenz, Tyr-Ser-Glu-Ala-Xaa-Glu-Ile-Ser, stimmte mit dem bovinen 14-3-3-Protein, Isoform gamma, überein.
Der 14-3-3-Antikörper reagierte spezifisch mit den Liquorproteinen 130 und 131 auf einem zweidimensionalen elektrophoretischen Immunoblot, reagierte aber nicht mit anderen Liquorproteinen und bestätigte so, dass die Liquorproteine 130 und 131 14-3-3-Proteine sind.
14-3-3-Immunoassay
Abbildung 2.
Abbildung 2. Immunfärbung für den polyklonalen Anti-14-3-3β-Kaninchen-Antikörper nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Bahn 1 zeigt Liquor von einem Patienten mit pathologischem Nachweis der Alzheimer-Krankheit, Bahnen 2 und 3 zeigen Liquor von zwei Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Bahn 4 zeigt Liquor von einer normalen Kuh, Bahn 5 zeigt Liquor von einer Kuh mit experimentell induzierter transmissibler Nerz-Enzephalopathie und pathologischem Nachweis einer spongiformen Erkrankung, Spur 6 zeigt normales menschliches Serum, Spur 7 zeigt Serum von einem Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Spur 8 zeigt einen Extrakt aus normalem menschlichem Gehirn, und Spur 9 zeigt gereinigtes Prionprotein aus dem Gehirn eines Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit.
Die Entdeckung, dass es sich bei den 30-kd-Spots im Liquor (Proteine 130 und 131) um 14-3-3-Proteine handelt, führte zur Entwicklung eines einfachen Immunoassays zur Unterstützung der Diagnose der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie. Wie Abbildung 2 zeigt, wurde in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit eine immunreaktive 30-kd-Bande gefunden (Spuren 2 und 3), während in der Zerebrospinalflüssigkeit von gesunden Kontrollen (Daten nicht gezeigt) oder von einem Patienten mit Alzheimer-Krankheit (Spur 1) keine solche Bande nachgewiesen wurde. Wie erwartet war 14-3-3 in einem Extrakt aus normalem menschlichem Gehirn reichlich vorhanden (Spur 8). Das 14-3-3-Protein wurde in normalem Serum (Spur 6) nicht gefunden; es wurde jedoch auch nicht im Serum von Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Spur 7) nachgewiesen. Das aus dem Gehirn eines Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit gereinigte Prionprotein (Spur 9) zeigte keine Kreuzreaktion mit dem 14-3-3-Antikörper, was bestätigt, dass 14-3-3 kein Prionprotein ist.
Tabelle 1.
Tabelle 1. Mit dem 14-3-3-Immunoassay untersuchte Liquor-Proben, je nach Diagnose. Tabelle 2.
Tabelle 2. Sensitivität und Spezifität des 14-3-3 Immunoassays für die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit.
Achtundsechzig von 71 Liquorproben von Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (96 Prozent) waren positiv für 14-3-3 (Tabelle 1 und Tabelle 2). Vier von 94 Proben (4 Prozent) von Patienten mit anderen Krankheiten, die mit Demenz einhergehen, waren positiv für 14-3-3 (Tabelle 1 und Tabelle 2) (P<0,001). Wenn Patienten mit Demenz, von denen bekannt war, dass sie innerhalb eines Monats vor dem Test einen akuten Hirninfarkt erlitten hatten, von der Analyse ausgeschlossen wurden, war nur 1 von 91 Proben (1 Prozent) positiv (P<0,001). Die Proben aller 10 Patienten mit Multi-Infarkt-Demenz, aber ohne Schlaganfall im Monat vor dem Test, waren negativ für 14-3-3. Das einzige falsch positive Ergebnis unter den Liquorproben der anderen Demenzpatienten stammte von einem Patienten mit einer klinischen Diagnose der Alzheimer-Krankheit, die nicht durch pathologische Untersuchungen verifiziert worden war.
14-3-3 wurde in 18 der 66 Liquorproben (27 Prozent) von Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen ohne Demenz nachgewiesen. Die 18 positiven Proben stammten von Patienten mit akuter viraler Enzephalitis, Schlaganfall (ohne Demenz) innerhalb eines Monats vor dem Test, Subarachnoidalblutung oder Rett-Syndrom. Die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit konnte vernünftigerweise nicht in die Differentialdiagnose einer dieser Erkrankungen einbezogen werden.
Insgesamt lag die Sensitivität des 14-3-3-Immunoassays als Marker für die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit bei 96 Prozent (68 wahr-positive Ergebnisse geteilt durch 71 wahr-positive und falsch-negative Ergebnisse; 95 Prozent Konfidenzintervall, 92 bis 99 Prozent) und die Spezifität bei 88 Prozent (164 wahr-negative Ergebnisse geteilt durch 186 wahr-negative und falsch-positive Ergebnisse; 95 Prozent Konfidenzintervall, 84 bis 92 Prozent). Noch wichtiger ist, dass die Spezifität dieses Assays bei allen Patienten mit Demenz 96 Prozent betrug (90 richtig negative Ergebnisse geteilt durch 94 richtig negative und falsch positive Ergebnisse; 95 Prozent Konfidenzintervall, 90 bis 96 Prozent), und wenn die drei Patienten mit Demenz und Hirninfarkt innerhalb eines Monats vor dem Test ausgeschlossen wurden, betrug die Spezifität des Immunoassays 99 Prozent (90 richtig negative Ergebnisse geteilt durch 91 richtig negative und falsch positive Ergebnisse; 95 Prozent Konfidenzintervall, 97 bis 100 Prozent) (Tabelle 1 und Tabelle 2).
Vergleich von zweidimensionaler Elektrophorese und Immunoassay
Tabelle 3.
Tabelle 3. Vergleich der zweidimensionalen Elektrophorese für die Proteine 130 und 131 und des 14-3-3 Immunoassays.
Wir verglichen den zweidimensionalen elektrophoretischen Assay für die Proteine 130 und 131 mit dem 14-3-3-Immunoassay in 50 Liquorproben (Tabelle 3). Dreizehn von 15 Proben von Patienten mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit waren mit beiden Tests positiv, und die anderen zwei Proben waren negativ für die Proteine 130 und 131, aber positiv für das 14-3-3-Protein. Die Ergebnisse der beiden Tests waren bei Proben von Patienten mit Demenzerkrankungen, die nicht mit der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit oder anderen neurologischen Störungen assoziiert sind, gleich. Obwohl die Spezifitäten der beiden Tests ähnlich sind, hat der 14-3-3-Immunoassay eine etwas höhere Empfindlichkeit.
14-3-3-Immunoassay in Tieren
Tabelle 4.
Tabelle 4. Ergebnisse des 14-3-3-Immunoassays in Liquor-Proben von Tieren.
Die Ergebnisse der Studien an Tieren stimmten mit denen der Studien an Menschen überein. Abbildung 2 zeigt die Testergebnisse in der Liquorflüssigkeit einer normalen Kuh (Spur 4) und einer Kuh mit pathologischem Nachweis einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (Spur 5). Wie Tabelle 4 zeigt, wurde 14-3-3-Protein im Liquor von sechs von neun Rindern mit experimentell induzierter transmissibler Nerz-Enzephalopathie oder Scrapie nachgewiesen. Die eine Kuh mit klinischen Merkmalen, aber ohne pathologischen Nachweis einer transmissiblen spongiformen Enzephalopathie hatte ebenfalls einen positiven Test. Kein Kontrollrind hatte einen positiven Test. Bei fünf von sechs Schafen mit natürlich erworbener Scrapie war der Test positiv, bei dem einen Kontrollschaf war er negativ. Bei allen 15 experimentell infizierten Schimpansen war der Test positiv, bei keinem der 77 Kontrollschimpansen dagegen. Die Gesamtsensitivität des 14-3-3-Immunoassays bei Tieren lag bei 87 Prozent, die Gesamtspezifität bei 99 Prozent.