Der Wasserstoff-Deuterium-Austausch

Der Wasserstoffaustausch wurde ursprünglich vom Vater des Wasserstoffaustauschs, Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang, mit Hilfe von Dichtegradientenröhren gemessen. In der Neuzeit wird der H-D-Austausch vor allem mit den Methoden: NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Neutronenkristallographie. Jede dieser Methoden hat ihre Vor- und Nachteile.

NMR-SpektroskopieEdit

Wasserstoff- und Deuteriumkerne unterscheiden sich stark in ihren magnetischen Eigenschaften. Daher ist es möglich, sie durch NMR-Spektroskopie zu unterscheiden. Deuteronen werden in einem 1H-NMR-Spektrum nicht beobachtet und umgekehrt werden Protonen in einem 2H-NMR-Spektrum nicht beobachtet. Werden in einem 1H-NMR-Spektrum einer stark deuterierten Probe kleine Signale beobachtet, so werden diese als Restsignale bezeichnet. Sie können zur Berechnung des Deuterierungsgrades eines Moleküls verwendet werden. Analoge Signale werden in 2H-NMR-Spektren aufgrund der im Vergleich zur 1H-Analyse geringeren Empfindlichkeit dieser Technik nicht beobachtet. Deuteronen weisen in der Regel sehr ähnliche chemische Verschiebungen wie ihre analogen Protonen auf. Eine Analyse mittels 13C-NMR-Spektroskopie ist ebenfalls möglich: die unterschiedlichen Spin-Werte von Wasserstoff (1/2) und Deuterium (1) führen zu unterschiedlichen Aufspaltungsmultiplikationen. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie kann die ortsspezifische Deuterierung von Molekülen bestimmt werden.

Eine andere Methode verwendet HSQC-Spektren. Typischerweise werden HSQC-Spektren zu einer Reihe von Zeitpunkten aufgezeichnet, während der Wasserstoff mit dem Deuterium ausgetauscht wird. Da das HSQC-Experiment spezifisch für Wasserstoff ist, nimmt das Signal exponentiell ab, wenn der Wasserstoff ausgetauscht wird. Es ist dann möglich, eine Exponentialfunktion an die Daten anzupassen, um die Austauschkonstante zu erhalten. Diese Methode liefert rückstandsspezifische Informationen für alle Rückstände im Protein gleichzeitig. Der größte Nachteil ist, dass sie eine vorherige Zuordnung des Spektrums für das betreffende Protein erfordert. Dies kann sehr arbeitsintensiv sein und beschränkt die Methode in der Regel auf Proteine mit einer Größe von weniger als 25 kDa. Da die Aufnahme eines HSQC-Spektrums Minuten bis Stunden dauert, müssen Amide, die schnell ausgetauscht werden, mit anderen Impulsfolgen gemessen werden.

MassenspektrometrieBearbeiten

Massenspektrometrie mit Wasserstoff-Deuterium-Austausch kann den Gesamt-Deuterium-Gehalt von Molekülen bestimmen, die einen H/D-Austausch erfahren haben. Aufgrund der erforderlichen Probenvorbereitung wird in der Regel davon ausgegangen, dass sie nur eine genaue Messung der nicht austauschbaren Wasserstoffatome ermöglicht. Sie kann auch einen H/D-Austausch in der Gasphase oder einen Austausch in der Lösungsphase vor der Ionisierung beinhalten. In der NMR-Spektroskopie hat sie mehrere Vorteile gegenüber der Analyse von H/D-Austauschreaktionen: Es wird viel weniger Material benötigt, die Probenkonzentration kann sehr niedrig sein (bis zu 0,1 uM), die Größengrenze ist viel größer, und die Daten können in der Regel viel schneller erfasst und interpretiert werden.

Der Deuteriumkern ist doppelt so schwer wie der Wasserstoffkern, da er sowohl ein Neutron als auch ein Proton enthält. Daher ist ein Molekül, das etwas Deuterium enthält, schwerer als eines, das nur Wasserstoff enthält. Wenn ein Protein zunehmend deuteriert wird, nimmt seine Molekülmasse entsprechend zu. Der Nachweis der Massenänderung eines Proteins bei Deuterierung wurde durch die moderne Protein-Massenspektrometrie ermöglicht, über die erstmals 1991 von Katta und Chait berichtet wurde.

Die Bestimmung der ortsspezifischen Deuterierung mittels Massenspektrometrie ist komplizierter als die Verwendung der NMR-Spektroskopie. So können beispielsweise der Ort und die relative Menge des Deuteriumaustauschs entlang des Peptidrückgrats grob bestimmt werden, indem das Protein einer Proteolyse unterzogen wird, nachdem die Austauschreaktion gequencht wurde. Einzelne Peptide werden dann auf die Gesamtdeuterierung jedes Peptidfragments analysiert. Bei dieser Technik wird die Auflösung des Deuteriumaustauschs durch die Größe der bei der Verdauung entstehenden Peptide bestimmt. Für die Proteolyse wird in der Regel Pepsin, eine saure Protease, verwendet, da der Quench-pH-Wert während der proteolytischen Reaktion aufrechterhalten werden muss. Um den Rückaustausch zu minimieren, müssen die Proteolyse und die anschließende massenspektrometrische Analyse so schnell wie möglich durchgeführt werden. Die HPLC-Trennung des peptischen Verdaus wird häufig bei niedriger Temperatur unmittelbar vor der Elektrospray-Massenspektrometrie durchgeführt, um den Rückaustausch zu minimieren. In jüngerer Zeit wurde die UPLC aufgrund ihrer überlegenen Trennfähigkeiten eingesetzt.

1999 wurde vorgeschlagen, dass es möglich sein könnte, die Auflösung einzelner Residuen durch die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) von deuterierten Peptiden in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie zu erreichen. Bald stellte sich heraus, dass die CID zu einem „Scrambling“ der Deuteriumposition innerhalb der Peptide führt. Die Fragmentierung, die durch den MALDI-In-Source-Zerfall (ISD), die Elektroneneinfangdissoziation (ECD) und die Elektronentransferdissoziation (ETD) erzeugt wird, verläuft jedoch unter den richtigen Versuchsbedingungen mit wenig oder gar keinem Scrambling. Scrambling der Isotopenmarkierung wird durch Kollisionserwärmung vor der Dissoziation des Ions verursacht, und während CID Scrambling verursacht, kann Kollisionserwärmung auch während der Ionisierung und des Ionentransports auftreten. Durch sorgfältige Optimierung der Geräteparameter, die die Ionenerwärmung verursachen, kann die Wasserstoffverschleppung jedoch so weit minimiert werden, dass die Isotopenmarkierung in der Lösungsphase erhalten bleibt, bis die Fragmentierung mit einer Technik durchgeführt werden kann, bei der keine Verschleppung auftritt. In jüngerer Zeit wurde auch die ultraviolette Photodissoziation (UVPD) als mögliche Fragmentierungstechnik zur Lokalisierung von Deuterium in Peptiden und Proteinen untersucht. Während es möglich ist, UVPD-Fragmente zu erhalten, bei denen unter bestimmten Bedingungen kein Scrambling auftritt, haben andere gezeigt, dass sowohl bei Peptiden als auch bei Proteinen während des UVPD-Fragmentierungsschritts selbst Scrambling auftreten kann. Die aktuelle Theorie, die diese scheinbaren Widersprüche zusammenfasst, hat mit dem doppelten Fragmentierungsweg zu tun, der sich aus der UV-Bestrahlung von Peptiden und Proteinen ergeben kann, d. h. direkte und statistische Dissoziation. Das heißt, wenn die experimentellen Bedingungen eine direkte Dissoziation begünstigen und das Vorläuferion vor und während der Fragmentierung auf niedrigen inneren Energien gehalten wird, entspricht der Deuteriumgehalt der resultierenden Fragmente dem des nicht-verwürfelten Vorläufers. Die experimentellen Bedingungen können jedoch die statistische Dissoziation während der UV-Bestrahlung begünstigen, insbesondere bei langen Bestrahlungszeiten und niedrigem Gasdruck, was zu einer internen Umwandlung der von den UV-Photonen eingebrachten elektronischen Anregungsenergie führt. Das Ergebnis ist eine Schwingungsanregung des bestrahlten Moleküls, die ihrerseits einer Verwürfelung unterliegt.

NeutronenkristallographieEdit

Der Wasserstoff-Deuterium-Austausch schnell wechselnder Spezies (z. B. Hydroxylgruppen) kann mit atomarer Auflösung quantitativ durch Neutronenkristallographie gemessen werden, und zwar in Echtzeit, wenn der Austausch während des Beugungsexperiments erfolgt.

Neutronenstrahlen hoher Intensität werden im Allgemeinen durch Spallation an Linac-Teilchenbeschleunigern wie der Spallationsneutronenquelle erzeugt. Neutronen beugen Kristalle ähnlich wie Röntgenstrahlen und können zur Strukturbestimmung verwendet werden. Wasserstoffatome, die in einer biologischen Umgebung zwischen einem und null Elektronen haben, beugen Röntgenstrahlen nur schlecht und sind unter normalen Versuchsbedingungen praktisch unsichtbar. Neutronen streuen an Atomkernen und sind daher in der Lage, Wasserstoff- und Deuteriumatome nachzuweisen.

Wasserstoffatome werden routinemäßig durch Deuterium ersetzt, was einen starken und positiven Streufaktor einbringt. Oft genügt es, nur die Lösungsmittel- und labilen Wasserstoffatome in einem Proteinkristall durch Dampfdiffusion zu ersetzen. In einer solchen Struktur wird die Belegung eines austauschbaren Deuteriumatoms in einem Kristall von 0-100% verfeinert, wodurch die Menge des Austauschs direkt quantifiziert wird.

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