Die saure Umwandlung von Nordiazepam kann die Wiederfindungsschätzung bei der Spurenanalyse von Diazepam und Nordiazepam in Umweltwasserproben durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Die Flüssigchromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-Systeme

Die entwickelten isokratischen sowie die Gradienten-Elutionssysteme lieferten eine gute Peak-Auflösung (Rs ≥ 3,1) für Diazepam und Nordiazepam. Im isokratischen System betrugen die Retentionszeiten 2,6 min (0,54 RSD %) und 4,1 min (0,27 RSD %) für die Standards von Nordiazepam-d5 bzw. Diazepam-d5. In der Oberflächenwassermatrix waren die Retentionszeiten die gleichen wie für die Standards und die RSD-Werte betrugen 0,62 % und 0,30 % für Nordiazepam-d5 bzw. Diazepam-d5. Die Retentionszeiten für die Arbeitsstandards im Gradientensystem betrugen 2,4 min (0,90 RSD %) und 2,9 min (0,70 RSD %) für Nordiazepam bzw. Diazepam. Die Präzision der Retentionszeiten für die Verbindungen im behandelten Abwasser ist in Tabelle 1 angegeben, wobei die RSD-Werte ≤ 0,35 % waren.

Diazepam und Nordiazepam wurden in den behandelten Abwasserproben anhand ihrer charakteristischen MS/MS-Übergänge und Retentionszeiten identifiziert (Tabelle 1). Für jede Verbindung wurden ein Vorläufer-Ion und zwei Fragment-Ionen überwacht. Zur Identifizierung von „natürlich“ vorkommendem Diazepam und Nordiazepam wurden die Verhältnisse der Peakflächen der beiden Fragment-Ionen mit denen der Standards verglichen (Tabelle 1). Außerdem wurden die Retentionszeiten für die Zielsubstanzen mit den Retentionszeiten für Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 im selben chromatographischen Lauf verglichen.

Entwicklung der Festphasenextraktionsmethode

Die Stabilität von Diazepam und Nordiazepam in sauren und neutralen wässrigen Proben

Gemeinsam gesammelte Umweltwasserproben werden vor der Analyse von neu auftretenden Kontaminanten üblicherweise bei saurem pH-Wert gelagert. In der vorliegenden Studie wurde die Stabilität von Diazepam und Nordiazepam bei Lagerung als Arbeitsstandards (bei pH 3,1 und pH 7,0) untersucht. Es wurde festgestellt, dass Nordiazepam bei Lagerung in saurer Lösung bei Raumtemperatur weitgehend abgebaut wurde. Innerhalb von 12 Tagen wurden 56 % des Nordiazepams abgebaut (Abb. 2). Der Abbau war nicht so umfangreich, wenn die Arbeitslösung bei 4 °C gelagert wurde; nach 12 Tagen waren 20 % der ursprünglichen Konzentration von Nordiazepam abgebaut. Andererseits erwies sich Diazepam bei pH 3,1 als stabil, wenn es bei Raumtemperatur und bei 4 °C gelagert wurde (Abb. 2). Innerhalb von 12 Tagen wurden nur 0,53 % bzw. 3,1 % des Diazepams bei Raumtemperatur bzw. bei 4 °C abgebaut. Beide Verbindungen erwiesen sich bei neutralem pH-Wert für 12 Tage als stabil. Am 12. Tag lagen die Reaktionen für Diazepam und Nordiazepam (bei Lagerung bei 4 °C und Raumtemperatur) bei 101-103 % der ursprünglichen Reaktionen. Die RSD-Werte (n = 3) für die ermittelten Konzentrationen zu verschiedenen Zeitpunkten waren ≤ 5,1 %. Die Reaktion wurde ursprünglich in Abwasserproben entdeckt, aber die Experimente wurden in vorbereiteten Lösungen durchgeführt, um die Bedingungen zu vereinfachen und die Möglichkeit anderer Reaktionen/Effekte in der sehr komplexen Matrix des Abwassers zu verringern.

Die Stabilität von Diazepam und Nordiazepam in 5 mM Ameisensäure in gereinigtem Wasser, pH 3. Diazepam gelagert bei 4 °C (weißes Dreieck) und bei Raumtemperatur (schwarzes Dreieck). Nordiazepam gelagert bei 4 °C (weißes Quadrat) und bei Raumtemperatur (schwarzes Quadrat). Experimentelle Details sind in „Stability studies of diazepam and nordiazepam in acidic and neutral aqueous solutions“

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Nordiazepam bei pH 3 instabil ist. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Ergebnissen in der Literatur, die zeigen, dass Nordiazepam in sauren Lösungen hydrolysiert. Archontaki et al. fanden heraus, dass Nordiazepam in sauren wässrigen Lösungen hydrolysiert wird und dass der erste Schritt des Abbaus reversibel ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie scheinen jedoch im Widerspruch zu den Ergebnissen einer neueren Studie zu stehen, in der festgestellt wurde, dass Nordiazepam (und Diazepam) bei pH 2 stabiler sind als bei pH 7. Der Unterschied ist eigentlich zu erwarten, wenn man die verschiedenen Strategien zur Bestimmung der Wiederfindung berücksichtigt. Da die Umwandlung von Nordiazepam während des Verdampfens und Erhitzens rückgängig gemacht wird, dürfte dies für die routinemäßige Anwendung der Methode keine praktischen Auswirkungen haben. Nur wenn die Wiederfindung gemäß den Empfehlungen von Matuszewski et al. in Kombination mit der Instabilität von Nordiazepam bei niedrigem pH-Wert geschätzt wird, ergibt sich ein Verlust der Verbindung und damit eine scheinbar hohe Wiederfindung.

Die Wiederfindungen der Festphasenextraktion für simulierte Umweltwasserproben, die bei niedrigem Proben-pH-Wert gelagert wurden

Die Wiederfindungen der Festphasenextraktion und der Matrixeffekt wurden in behandelten Wasserproben mittels LC-MS unter Verwendung des von Matuszewski et al. vorgeschlagenen Ansatzes bestimmt, Einzelheiten sind in „Methodenvalidierung“ angegeben. Die Wiederfindungsraten der Extraktion wurden für die isotopenmarkierten Standards Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 bestimmt, da die markierten Verbindungen in den Umweltmatrices nicht zu erwarten sind. In der vorliegenden Studie wurden die Arbeitsstandards von Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 in 5 mM Ameisensäure in gereinigtem Wasser pH 3,1/Acetonitril (90/10, v/v) nicht länger als 1 Woche bei 8 °C gelagert und zur Herstellung der Sets A-C verwendet.

Die relativen Extraktionswiederfindungen, die bei einer niedrigen und einer hohen Konzentration bestimmt wurden, sind in Tabelle 2 angegeben (die Extraktionsmethode ist in „Probenvorbereitung und Festphasenextraktion“ beschrieben). Die Extraktionsausbeuten waren für Nordiazepam-d5 höher als für Diazepam-d5. Für Nordiazepam-d5 betrugen die relativen Extraktionswiederfindungen 114 ± 8,1% und 117 ± 21% bei der niedrigen bzw. hohen Konzentration. Die für Diazepam-d5 erhaltenen RSD-Werte betrugen 6,0 % und 24 % für die niedrige bzw. hohe Konzentration (Tabelle 2). Hohe RSD-Werte (≥ 18 %) für das Festphasenextraktionsverfahren werden manchmal bei der Bestimmung von Spuren in komplexen Matrices erzielt. Darüber hinaus wurde in der Literatur bereits über hohe Wiederfindungsraten (≥ 100 %) für Nordiazepam in Umweltwasserproben berichtet. Wie weiter unten erörtert wird, könnten die hohen Wiederfindungen mit einem chemischen Gleichgewicht zwischen Nordiazepam und einem Transformationsprodukt korreliert sein.

Die absolute Extraktionswiederfindung für Nordiazepam-d5 wurde mit 139 ± 21% und der Matrixeffekt mit 119 ± 3,0% bestimmt. Die hohe absolute Extraktionsausbeute für Nordiazepam-d5 kann teilweise dadurch erklärt werden, dass Nordiazepam-d5 in der MS-Schnittstelle einer Ionenanreicherung unterworfen war. Wir haben jedoch gezeigt, dass die hohen Extraktionsgewinnungen (> 100% für die relative Extraktion, wie oben beschrieben) nicht nur durch Matrixeffekte in der ESI-Quelle verursacht wurden. Dies wurde anhand der relativen Extraktionsgewinnungen nach Matuszewski et al. festgestellt, bei denen die extrahierten und die nicht extrahierten Proben in der gleichen Matrix gelöst in das LC-MS/MS-System injiziert wurden. Um zusätzlich zu überprüfen, dass die hohen Extraktionswiederfindungen nicht mit einem Prozess in der Schnittstelle des Massenspektrometers korreliert sind, wurden die Extraktionswiederfindungen für Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 durch den Einsatz einer zweiten Detektionstechnik, LC-UV, bestimmt. Die Wiederfindung für eine extrahierte Probe von Nordiazepam-d5 in Phosphatpuffer (pH 7,0), die sowohl mit LC-MS/MS als auch mit LC-UV analysiert wurde, betrug 159 bzw. 153 % (n = 2). Wir kamen zu dem Schluss, dass die hohen Extraktionsgewinnungsraten für Nordiazepam zu einem großen Teil nicht auf einen Prozess im Massenspektrometer zurückzuführen sind.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die erzielten Extraktionsgewinnungsraten und die RSD-Werte zwar hoch waren, aber wahrscheinlich angemessen erscheinen, da die Konzentrationen der Zielverbindungen niedrig waren (50 und 250 pM) und die Verbindungen aus einer komplexen Matrix extrahiert wurden. In dieser Studie wollten wir zeigen, dass diese hohen Wiederfindungsraten für Nordiazepam mit einem chemischen Gleichgewicht zwischen Nordiazepam und einem Transformationsprodukt korreliert sein könnten, das von Archontaki et al. gefunden wurde.

Regeneration von Nordiazepam während der Probenvorbereitung

Wenn gelagerte Lösungen von Diazepam und Nordiazepam (pH 3.1, bei Raumtemperatur, „Die Stabilität von Diazepam und Nordiazepam in sauren und neutralen wässrigen Proben“) verwendet wurden, um den Phosphatpuffer zu spiken und dann einer Festphasenextraktion unterzogen wurden, waren die Antworten, die von den rekonstituierten Extrakten von Nordiazepam erhalten wurden, größer im Vergleich zu den Antworten, die von den nicht-extrahierten gelagerten Lösungen erhalten wurden. Bei der Festphasenextraktion hatte sich die Peakfläche von Nordiazepam von 26 Flächenzählungen (2,7 RSD %, n = 3) auf 45 Flächenzählungen (14,6 RSD %, n = 3) erhöht.

Um zu überprüfen, ob Nordiazepam während der Festphasenextraktion regeneriert wurde, wurden eine gelagerte Probe von Nordiazepam-d5 (mit einer Peakfläche von 1470 für das Fragment-Ion von m/z 213) und eine verarbeitete Probe von Nordiazepam-d5 (mit einer Peakfläche von 1790) in das LC-MS/MS-System injiziert. Zusätzlich zu dem SRM-Kanal von Nordiazepam-d5 (276 → 213) wurden zwei weitere SRM-Kanäle erfasst (Tabelle 1). Die gespeicherten Proben von Nordiazepam-d5 wurden injiziert (n = 6), und die Verhältnisse der SRM-Übergänge wurden zu 1,4 (3,8 RSD %, Fragment-Ionen-Verhältnis von m/z (276 → 213)/(276 → 165) und 1,0 (3,5 RSD %, Fragment-Ionen-Verhältnis von m/z (276 → 213)/(276 → 140) bestimmt. Bei der verarbeiteten Probe von Nordiazepam-d5 waren die Verhältnisse der SRM-Übergänge gleich, d. h. 1,4 und 1,0. Somit gab es keine signifikanten Unterschiede in den Fragment-Ionen-Verhältnissen zwischen den gelagerten und den bearbeiteten Proben. Außerdem waren die Retentionszeiten für beide Proben gleich. Daraus wurde gefolgert, dass Nordiazepam-d5 sowohl in den gelagerten als auch in den verarbeiteten Proben nachgewiesen wurde.

Archontaki et al. fanden heraus, dass Nordiazepam in saurer wässriger Lösung in das Zwischenprodukt N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid mit der Summenformel C15H13N2O2Cl und der monoisotopischen Masse 288,1 Da umgewandelt wurde. Das Transformationsprodukt wurde kristallisiert und mittels LC-UV, GC-MS, 1H- und 13C-NMR sowie IR-Spektroskopie analysiert. Das chemische Gleichgewicht zwischen dem Zwischenprodukt und Nordiazepam war reversibel, die weitere Umwandlung des Zwischenprodukts in das endgültige Abbauprodukt (C13H10NOCl) war jedoch nicht reversibel. In der vorliegenden Studie wurde ein Ion mit einer Retentionszeit von 3,0 min und einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 289,0 mittels LC-MS in einer gelagerten Lösung (pH 3,1) von Nordiazepam nachgewiesen. Dieses Ion könnte dem + des Transformationsprodukts von Nordiazepam entsprechen. Außerdem stimmte das Isotopenmuster des Ions bei 3,0 min mit dem Isotopenmuster für ein Chloratom überein. Außerdem eluierte der chromatographische Peak vor Nordiazepam, was mit den Ergebnissen der Trennungen von Nordiazepam und N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid in dem von Archontaki et al. verwendeten Umkehrphasensystem übereinstimmt. Darüber hinaus betrug das Peakflächenverhältnis von Nordiazepam zu N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid in dieser gelagerten Wasserlösung in der vorliegenden Studie 0,75 (n = 2). In den eingedampften Methanolmischungen (experimentelle Details sind in „Stabilitätsstudien von Diazepam und Nordiazepam in sauren und neutralen wässrigen Lösungen“ beschrieben) stieg das Peakflächenverhältnis von Nordiazepam zu N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid jedoch auf 1,9 (6,8 RSD %, n = 4), d.h., die Peakfläche von Nordiazepam nahm zu und die Peakfläche von N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid nahm ab im Vergleich zu der Probe, die nicht eingedampft wurde. In der Blindprobe wurden keine Peaks für N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid oder Nordiazepam nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass sich das chemische Gleichgewicht von Nordiazepam und dem von Archontaki et al. charakterisierten Transformationsprodukt von N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid zur Bildung von Nordiazepam während der Verdampfung der SPE-Extrakte verschoben hat. Es wurde kein Peak entdeckt, der mit dem endgültigen Abbauprodukt (C13H10NOCl) von Nordiazepam korreliert werden konnte.

Daraus wurde geschlossen, dass Nordiazepam in der sauren Wasserlösung leicht in N-(2-Benzoyl-4-chlorphenyl)-2-aminoacetamid umgewandelt wurde. Interessanterweise wurde Nordiazepam während des Prozesses der Festphasenextraktion regeneriert. Die Verwendung der gelagerten Lösungen von Nordiazepam bei einem pH-Wert von 3,0 als Referenz für die Berechnung der Extraktionsausbeuten führt daher zu einer Überschätzung der Extraktionsausbeuten. Diese Ergebnisse sind bei der Methodenvalidierung von Bedeutung, d. h. bei der Bewertung der Lagerungsbedingungen, der Extraktionsausbeuten und der Matrixeffekte. Darüber hinaus kann die Umwandlung von Nordiazepam die analytischen Gesamtergebnisse beeinflussen, wenn kein isotopenmarkiertes Analogon zu Nordiazepam als interner Standard verwendet wird. Es muss auch betont werden, dass die Umwandlung von Nordiazepam die Genauigkeit der Methode beeinflussen kann, nicht nur während der Lagerung vor der Festphasenextraktion, sondern auch in Abhängigkeit vom pH-Wert der verwendeten Lösung, z. B. bei der Rekonstitution der getrockneten SPE-Extrakte.

Methodenvalidierung

Die entwickelte Methode wurde durch die Verwendung der isotopenmarkierten Analoga, Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5, validiert („Methodenvalidierung“), da diese Verbindungen in den Umweltproben nicht nachgewiesen wurden. Der Vorteil der Verwendung der markierten Analoga für die Methodenvalidierung besteht darin, dass die Methode im Spurenbereich in der tatsächlichen Matrix, in der die Analyten quantifiziert werden, validiert werden kann. Die relativen Wiederfindungsraten der Extraktion in den behandelten Abwasserproben betrugen ≥ 87 % für Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 in der hohen und niedrigen Konzentration (Tabelle 3). Die erhaltenen Werte liegen im Bereich dessen, was bei der Extraktion von Arzneimittelkonzentrationen im Spurenbereich aus komplexen Matrices erwartet werden kann. Die absoluten Wiederfindungsraten der Extraktion waren mit 63-86 % niedriger, da die Analyten einer Ionensuppression unterworfen waren (Tabelle 3). Bei der niedrigen Konzentration betrugen die Matrixeffekte (ME %) 76 ± 14 % und 88 ± 14 % für Diazepam-d5 bzw. Nordiazepam-d5 (Tabelle 3). Bei der hohen Konzentration lagen der Matrixeffekt und die RSD-Werte im gleichen Bereich wie bei der niedrigen Konzentration. Diese Werte von ME % liegen im akzeptablen Bereich, da Ergebnisse aus anderen Studien zeigen, dass der Matrixeffekt bei Umwelt-Wasser-Matrices relativ hoch sein kann. Die Genauigkeit der Methode wurde durch die Bestimmung der SPE-Wiederfindungen bei der niedrigen und der hohen Konzentration von Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 bestimmt (Tabelle 3). Die relativen Wiederfindungen betrugen 88 ± 7,6 % und 87 ± 12 % für Diazepam-d5 in der niedrigen bzw. hohen Konzentration und 98 ± 7,8 % und 99 ± 6,1 % für Nordiazepam-d5.

Die Präzision des chromatographischen Systems, ausgedrückt als die RSD-Werte der Retentionszeiten von Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 in extrahierten Abwasserproben, war ≤ 0,62 %. Die RSD-Werte der Peakflächen für Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 in den extrahierten Abwasserproben betrugen ≤ 7,8 % („Die Flüssigchromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-Systeme“). Darüber hinaus betrug die Linearität, ausgedrückt als Korrelationskoeffizient (R2) der Kalibrierkurven in den behandelten Abwasserproben, 0,988 und 0,957 für Diazepam bzw. Nordiazepam.

In dieser Studie wurde keine Verschleppung im LC-MS/MS-System beobachtet, da keine Peaks der Analyten oder der isotopenmarkierten Verbindungen in einer der injizierten gereinigten Millipore-Wasserproben nachgewiesen wurden. Es gab keine Anzeichen für eine Kreuzkontamination während der Probenbehandlung oder der Festphasenextraktion, da die extrahierten Phosphatpufferproben keine der Zielverbindungen enthielten. Das Risiko falsch positiver Ergebnisse aufgrund von Selbstkontamination wurde daher in dieser Studie als minimiert angesehen.

Die LOQ und LOD für Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 wurden in behandelten Abwasserproben bestimmt. Die Bestimmungsgrenzen wurden sowohl für Diazepam-d5 als auch für Nordiazepam-d5 auf 5,0 pM (1,4 ng L-1) festgelegt, wobei das Signal-Rausch-Verhältnis etwa 10 und die erzielte Präzision 12,7 und 15,9 RSD % (n = 3) für die jeweiligen Verbindungen betrug (Tabelle 3), d.h. innerhalb der vorgeschriebenen Präzision von 20 %. Die in der vorliegenden Studie erzielten LOQ-Werte liegen im Bereich dessen, was in anderen Studien für Diazepam und Nordiazepam in behandelten Abwasserproben erreicht wurde. In dieser Studie wurde jedoch ein Volumen von 200 mL behandelten Abwassers extrahiert, im Vergleich zu 75 mL in unserer vorgestellten Methode. Die Nachweisgrenzen betrugen 1,7 pM (0,49 ng L-1) und 2,0 pM (0,55 ng L-1) für Diazepam-d5 bzw. Nordiazepam-d5 (Tabelle 3).

Wie oben beschrieben („Die Stabilität von Diazepam und Nordiazepam in sauren und neutralen wässrigen Proben“, Abb. 2), erwiesen sich Diazepam und Nordiazepam bei einem Proben-pH-Wert von 7,0 für 12 Tage als stabil.0 stabil, wenn sie bei Raumtemperatur oder bei 4 °C gelagert werden.

Quantifizierung von Diazepam und Nordiazepam in Umweltwasserproben

Die entwickelte LC-MS/MS-Methode wurde auf Umweltwasserproben zur Bestimmung von Diazepam und Nordiazepam angewendet. Es muss betont werden, dass die entwickelte Methode für die Bestimmung von Diazepam und Nordiazepam in Umweltproben unter sauren Bedingungen eingesetzt werden kann, wenn den Proben vor der Lagerung ideale interne Standards zugesetzt werden, d.h. isotopenmarkierte Verbindungen der Zielsubstanzen. In dieser Studie wurden die isotopenmarkierten Verbindungen Diazepam-d5 und Nordiazepam-d5 als interne Standards verwendet, um die mögliche Umwandlung der Verbindungen und andere Verluste sowie Schwankungen während der Analyse zu kompensieren.

Behandelte Abwasser- und Oberflächenwasserproben wurden auf Diazepam und Nordiazepam analysiert. Es gab keine signifikanten Unterschiede auf dem 5 %-Niveau in einem t-Test zwischen den Ionenverhältnissen, die für Standardlösungen (Tabelle 1) erhalten wurden, und denen, die für das „natürlich“ vorkommende Diazepam oder Nordiazepam erhalten wurden (P ≥ 0,07). Die Konzentrationen von Diazepam und Nordiazepam wurden mit 8,5 (2,4 ng L-1) bzw. 66 pM (18 ng L-1) bestimmt. In Proben aus derselben Kläranlage, die 14 Tage später entnommen wurden, wurden die Konzentrationen von Diazepam und Nordiazepam mit 7,5 (2,1 ng L-1) bzw. 75 pM (20 ng L-1) bestimmt. Die Konzentrationen von Nordiazepam sind also etwa eine Größenordnung höher als die von Diazepam. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Resultaten aus anderen Untersuchungen von Abwässern. Darüber hinaus wurde in einigen behandelten Abwasserproben, über die in der Literatur berichtet wird, Nordiazepam quantifiziert, aber Diazepam wurde nicht nachgewiesen. In der vorliegenden Studie wurde weder Diazepam noch Nordiazepam im Oberflächenwasser des Flusses Fyris, 3 km flussaufwärts von der Kläranlage Kungsängsverket, nachgewiesen, was auf wenige anthropogene Abwasseremissionen flussaufwärts hinweist.