Der Biophysiker Adam Cohen schlenderte 2010 durch San Francisco, Kalifornien, als er von einem Telefonanruf überrascht wurde. „Wir haben ein Signal“, sagte der Anrufer. Fast 5.000 Kilometer entfernt, in Cambridge, Massachusetts, waren seine Mitarbeiter fündig geworden. Nach monatelangen fehlgeschlagenen Experimenten hatten die Forscher ein fluoreszierendes Protein gefunden, mit dem sie Signale auf ihrem Weg zwischen den Neuronen beobachten konnten.
Aber irgendetwas war seltsam an der Sache. Als Cohen in sein Labor an der Harvard University zurückkehrte, stellte er fest, dass alle Aufzeichnungen des Experiments einen seltsamen Verlauf aufwiesen. Zunächst blinkten die mit dem Protein verzierten Neuronen schön auf, als elektrische Impulse durch sie hindurchflossen. Doch dann verwandelten sich die Zellen in helle Kleckse. „Auf halbem Weg durch jede Aufnahme wurde das Signal ganz wild“, sagt Cohen.
So beschloss er, sein Team bei einem Experiment zu begleiten. „Als sie mit der Aufnahme begannen, saßen sie da und hielten den Atem an“, sagt Cohen. Aber sobald sie merkten, dass es funktionierte, feierten sie, „tanzten und rannten durch den Raum“.
In ihrem Überschwang ließen sie das Licht einer Schreibtischlampe direkt auf das Mikroskop scheinen. „Wir haben unsere Aufregung aufgezeichnet“, sagt Daniel Hochbaum, damals Doktorand in Cohens Gruppe. Ein Jahr später veröffentlichte das Team seine Studie1 – eine der ersten, die zeigte, dass ein fluoreszierendes Protein, das in bestimmte Säugetierneuronen eingebaut wurde, dazu verwendet werden kann, einzelne elektrische Impulse in Echtzeit zu verfolgen.
Neurowissenschaftler haben jahrzehntelang versucht, die schnellen elektrischen Signale zu beobachten, die eine wichtige Komponente der Sprache des Gehirns sind. Obwohl Elektroden, das Arbeitspferd für die Spannungsmessung, die Aktivität einzelner Neuronen zuverlässig aufzeichnen können, haben sie Schwierigkeiten, die Signale vieler Neuronen zu erfassen, insbesondere über längere Zeiträume. In den letzten zwei Jahrzehnten haben Wissenschaftler jedoch einen Weg gefunden, fluoreszierende Proteine, die die Spannung anzeigen, direkt in die Zellmembranen der Neuronen einzubetten. Mit der richtigen Art von Mikroskop können sie dann sehen, wie die Zellen aufleuchten, wenn sie miteinander sprechen – sei es flüsternd oder schreiend. Die Spannungsbildgebung kann auch das elektrische Geplapper zwischen vielen Neuronen auf einmal aufzeichnen und diese Signale dann über große Teile des Hirngewebes mitteln. Dies hilft den Forschern, die elektrische Aktivität des Gehirns in verschiedenen räumlichen Maßstäben zu untersuchen, indem sie nicht nur die Stimmen einzelner Zellen, sondern auch „das Brüllen der Menge“ hören, so Cohen.
In den letzten 5 Jahren haben Wissenschaftler etwa 1.000 Arbeiten zu diesem Thema veröffentlicht, und große Förderprogramme wie die BRAIN-Initiative der US National Institutes of Health haben die Entwicklung neuer Arten von gentechnisch veränderten Spannungsindikatoren beschleunigt. In der Hoffnung, bessere Varianten zu finden, haben einige Gruppen Strategien entwickelt, um Millionen von Proteinen auf gewünschte Eigenschaften wie Helligkeit zu untersuchen. Ein solcher Ansatz hat einen Indikator identifiziert, der doppelt so hell ist wie ähnliche Sensoren, die nur vier Jahre zuvor entwickelt wurden2.
Mit der Verbesserung dieser Proteine und den Fortschritten in der Mikroskopie, die es einfacher machen, sie zu sehen, hoffen die Wissenschaftler, das größte Rätsel der Neurowissenschaften zu erhellen: wie die Zellen des Gehirns zusammenarbeiten, um ein System elektrischer Impulse in Gedanken, Handlungen und Emotionen zu verwandeln. Die Forscher kämpfen noch immer darum, das gesamte Spektrum der Aktivitäten zu erfassen und Wege zu finden, um zu sehen, wie die Nerven schnell und tief im Hirngewebe feuern. Aber wenn Fortschritte diese technischen Herausforderungen lösen können, „wäre das revolutionär“, sagt Rafael Yuste, der an der Columbia University in New York City die Funktion neuronaler Schaltkreise untersucht.
Hochgeschwindigkeitsverfahren
Das durchschnittliche menschliche Gehirn enthält etwa 120 Milliarden Neuronen, die ständig Informationen über verzweigte Anhängsel, die Dendriten, empfangen und senden. Chemische oder elektrische Signale, die die Dendriten erreichen, erzeugen kleine Spannungsänderungen an der Zellmembran, die an den Zellkörper weitergeleitet werden. Wenn die Summe der Spannungsänderungen einen Punkt erreicht, an dem es kein Zurück mehr gibt, den so genannten Schwellenwert, gibt das Neuron eine große elektrische Spitze ab – ein Aktionspotenzial. Dieser Stromstoß saust mit einer Geschwindigkeit von bis zu 150 Metern pro Sekunde entlang eines neuronalen Astes, dem so genannten Axon, zu einem anderen Satz von verzweigten Fortsätzen. Hier leiten chemische oder elektrische Signale die Informationen an den nächsten Satz von Dendriten weiter.
Neuronale Signale konvergieren, divergieren und synchronisieren, um eine Symphonie von Gedanken, Emotionen, Aktionen und Reaktionen zu erzeugen, vom Erröten eines Gesichts bis zum Schluckauf eines Babys. Doch die Hörwerkzeuge der Wissenschaftler sind äußerst begrenzt. Erstmals in den 1940er Jahren entwickelt, können Miniaturelektroden, die so dünn wie ein Haar sind, in das Gehirn, an oder in die Neuronen eingeführt werden, wo sie die Membranspannung mit Präzision und Geschwindigkeit messen. Mit dieser Methode können jedoch nur ein oder eine Handvoll Neuronen auf einmal überwacht werden – und das auch nur für eine begrenzte Zeit, da die Elektroden die Zelle schließlich beschädigen. Das ist so, als würde man versuchen, das Wesentliche eines Orchesterarrangements zu verstehen, indem man einem einzelnen Spieler ein paar Sekunden lang folgt.
Mikroelektrodenbündel können die elektrische Aktivität von bis zu 200 Zellen gleichzeitig aufzeichnen, aber da diese Elektroden in der Nähe der Neuronen und nicht in ihrem Inneren angebracht werden, können sie nur die Aktionspotentiale, die schärfsten Ausschläge der elektrischen Aktivität, erfassen. Sie sind taub für leisere Töne – die kleinen elektrischen Veränderungen, die das Neuron nicht bis zu einem Aktionspotenzial treiben. Diese Spannungsänderungen unterhalb der Schwelle sind der Schlüssel zur Gehirnfunktion, denn sie summieren sich allmählich und bestimmen, ob ein Neuron feuert oder nicht.
In der Hoffnung, leisere Gehirnaktivitäten in größeren Zellpopulationen messen zu können, begannen Wissenschaftler in den 1960er Jahren mit der Idee eines Sensors oder einer Sonde zu spielen, die als Reaktion auf ein elektrisches Signal fluoresziert. Die bekanntesten Sonden, die so genannten Kalziumindikatoren, leuchten auf, wenn sie an Kalzium binden, das als Folge einer elektrischen Aktivitätsspitze in das Neuron fließt. Die als Kalzium-Imaging bezeichnete Technik liefert jedoch nur einen Näherungswert; sie zeichnet die Membranspannung nicht direkt auf. Und obwohl sie das Signal von großen Ereignissen wie Aktionspotenzialen zeigt, entgehen ihr Dinge, die für die Gehirnfunktion entscheidend sind, wie subtile Schwankungen der Membranspannung oder die elektrischen Signale, die Aktionspotenziale hemmen. Stellen Sie sich vor, Sie hören nur den Applaus nach einem Symphoniekonzert: Es ist klar, dass das Orchester gespielt hat, aber was es gespielt hat, kann man nicht sagen.
In den 1970er Jahren begannen Wissenschaftler mit der Entwicklung von Farbstoffsensoren, die Änderungen der Membranspannung direkt erkennen. Die ersten Versionen dieser Farbstoffe mussten wahllos auf das Gehirn aufgetragen werden, so dass sie alle Zelltypen markierten, auch nicht-neuronale Zellen, was es schwierig machte, die Aktivität bestimmter Neuronen zu analysieren.
In den 1990er Jahren begannen die Forscher mit der Erprobung von Indikatoren, die gentechnisch so verändert werden konnten, dass sie nur in den interessierenden Neuronen auftauchten. Der erste3 genetisch kodierte Spannungsindikator (GEVI) wurde 1997 entwickelt; seither haben die Wissenschaftler mehr als zwei Dutzend Sensoren4 entwickelt. Einige von ihnen werden durch die Kombination eines spannungsempfindlichen Proteins mit fluoreszierenden Molekülen hergestellt (siehe ‚Die Geschmacksrichtungen der Fluoreszenz‘). Wenn diese Proteine eine Spannungsänderung erkennen, verändern sie ihre 3D-Struktur und die Fluoreszenz des Moleküls, an das sie gekoppelt sind. Andere Spannungsindikatoren sind mutierte Versionen von mikrobiellen Rhodopsinen, fluoreszierende Moleküle, die als Reaktion auf Licht eine Spannungsänderung an der Plasmamembran verursachen. Diese Proteine können auch in umgekehrter Weise funktionieren, indem sie ihre Reaktion auf Licht – und damit ihre Fluoreszenz – als Reaktion auf eine Änderung der Membranspannung ändern.
Alles im Detail
Bislang haben sich GEVIs als erfolgreich erwiesen, wenn es darum ging, einzelne Aktionspotenziale sowohl in kultivierten Neuronen, die in einer Schale gezüchtet wurden, als auch in den intakten Gehirnen einer breiten Palette von Tieren, von Insekten5 bis zu Mäusen6, zu verfolgen. Eines der größten Versprechen der Technik ist ihr Potenzial, nicht nur die großen Ereignisse aufzuzeichnen, sondern auch die kleinen, unterschwelligen Änderungen der Membranspannung, die die Nachrichten widerspiegeln, die ein Neuron von benachbarten Zellen empfängt, sagt Cohen. „
Im vergangenen Jahr haben Cohen und seine Kollegen neue GEVIs und verbesserte Mikroskopietechniken entwickelt, um solche subschwelligen Spannungsänderungen von vielen Neuronen gleichzeitig aufzuzeichnen, auch im Maushirn7,8. Das Team war auch in der Lage, die elektrische Aktivität der gleichen Neuronen bis zu einer Woche später aufzuzeichnen. Die Möglichkeit, genau zu wissen, welche Neuronen aufgezeichnet werden, und sie über einen längeren Zeitraum zu verfolgen, ermöglicht es den Forschern, die Verdrahtung zwischen diesen Neuronen zu untersuchen, sagt Ed Boyden, ein Neurowissenschaftler am Massachusetts Institute of Technology in Cambridge. Auf diese Weise „kann man die Struktur des Gehirns mit seiner Funktion verknüpfen“, sagt er.
Ein weiterer Vorteil der GEVIs besteht darin, dass sie im Gegensatz zu Elektroden, die hauptsächlich Signale aus dem Zellkörper aufzeichnen, elektrische Signale aus jedem Teil einer Nervenzelle aufzeichnen können, bis hin zu den Spitzen der Dendriten (siehe „Auf die Waage bringen“). Das ist so, als ob man speziell die Noten hören könnte, die von der linken Hand eines Pianisten gespielt werden. „Davon habe ich lange geträumt – und ich bin nicht allein“, sagt Katalin Toth, Neurobiologin an der Laval-Universität in Quebec City, Kanada. Viele Neurowissenschaftler streben danach, die Spannung über ganze Neuronen hinweg zu verfolgen, um zu sehen, wie sie sich in verschiedenen Regionen der Zelle verändert, sagt sie.
Wei Wei, ein Neurobiologe an der Universität von Chicago, Illinois, verwendet GEVIs, um herauszufinden, wie verschiedene elektrische Eingänge in den Neuronen der Mäusenetzhaut integriert werden. Wei interessiert sich für eine Klasse von Neuronen, die stärker auf einen visuellen Reiz reagieren, wenn sie sich in eine bestimmte Richtung bewegen. Indem sie untersucht, wie sich die Membranspannung in verschiedenen Teilen dieser Neuronen ändert, hofft sie zu verstehen, wie die Zellen die eingehenden Signale summieren, um die Richtung der Bewegung zu erkennen.
Der Neurophysiologe Vincent Villette von der Ecole Normale Supérieure in Paris plant, mit Hilfe von Spannungssensoren zu untersuchen, wie regelmäßige Fluktuationen von elektrischen Signalen unterhalb der Schwelle bestimmen, wie Neuronen im Kleinhirn der Maus die Muskelaktivität koordinieren. „Es gibt viel darüber zu verstehen, wie Zellen zusammenarbeiten“, sagt Villette.
Die visuelle Anzeige der Membranspannung ermöglicht es den Wissenschaftlern auch, elektrische Signale zu erkennen, die das Feuern von Neuronen hemmen, anstatt es auszulösen. Da hemmende Signale mit Methoden wie der Kalzium-Bildgebung nicht erfasst werden können, ist unklar, wie genau sie die Hirnaktivität beeinflussen, sagt Rosa Cossart, Neurobiologin am Institut für Neurobiologie des Mittelmeerraums in Marseille, Frankreich.
Cossart verwendet schon seit Jahren Elektroden und Kalzium-Imaging, aber jetzt möchte sie GEVIs ausprobieren. Sie hofft, dass diese Sensoren es ihr ermöglichen werden, die Spannung in mehreren Neuronen – mindestens 50 – gleichzeitig in einer lebenden Maus mit hoher Geschwindigkeit zu messen. Dies würde helfen zu verstehen, wie Gruppen von Neuronen elektrische Signale – sowohl erregende als auch hemmende – integrieren, um Aktivitäten zu unterstützen, die für die Entwicklung und Funktion des Gehirns entscheidend sind, sagt sie.
Tiefe Herausforderungen
Trotz der hohen Erwartungen kann es schwierig sein, GEVIs im Labor zum Laufen zu bringen. Beispiel Helen Yang: Als Doktorandin an der kalifornischen Stanford University beschloss sie, GEVIs auszuprobieren, um Neuronen im Sehsystem der Fruchtfliege zu untersuchen. Doch als Yang bei ihrem ersten Experiment durch das Mikroskop blickte, konnte sie keine Veränderung der Fluoreszenz der Zellen feststellen, auch nicht, als sie die Augen der Fliegen mit einem hellen Licht bestrahlte. Erst als sie die Daten analysierte, wurde ihr klar, dass die visuellen Reize ein Signal erzeugten, wenn auch nur ein winziges. „Ich war ziemlich aufgeregt, aber meine Laborkollegen waren es weniger“, sagt sie. „Die Antworten waren ziemlich klein und verrauscht.“
Yang begann mit den Mikroskopeinstellungen zu spielen, erhöhte die Laserleistung und beschleunigte die Bildgebung. „Ich habe es im Grunde so schnell gemacht, wie unser Mikroskop es konnte“, sagt sie. Denn die Reaktion des Indikators auf ein elektrisches Signal war so schnell, dass die Veränderung der Fluoreszenz nur für den Bruchteil einer Sekunde zu erkennen war. „Wenn man während der Zeit, in der die Zelle reagiert, nur ein Bild aufnimmt, sieht die Reaktion überhaupt nicht groß aus“, sagt Yang.
Yang gelang es schließlich, GEVIs zu verwenden, um zu untersuchen, wie die Neuronen der Fliegen visuelle Signale verarbeiten5, aber die Art von Herausforderungen, mit denen sie konfrontiert war, haben bisher verhindert, dass die Spannungsbildgebung zu einer gängigen Technik wurde. Sie erfordert fortschrittliche, oft speziell angefertigte Mikroskopplattformen, sagt Cohen. „Man kann das nicht einfach mit dem Fluoreszenzmikroskop der Großmutter machen.“
In den letzten fünf Jahren hat die finanzielle Unterstützung durch die BRAIN-Initiative die Fortschritte auf diesem Gebiet gefördert, einschließlich der Entwicklung besserer GEVIs, sagt Michael Lin, ein Proteiningenieur in Stanford.
Parallel zur Entwicklung neuer Sensoren arbeiten die Wissenschaftler an Techniken, um die schnellen elektrischen Signale, die das Gehirn durchlaufen, präzise abzubilden. Eine Herausforderung besteht darin, dass die meisten der verfügbaren Techniken nur mit Zellen in einer Schale oder auf der Oberfläche des Gehirns gut funktionieren. Aber das Gehirn von Säugetieren ist nicht durchsichtig, sondern sieht aus wie Tofu, sagt Na Ji, Physiker an der University of California, Berkeley.
Um in die Tiefe zu blicken, müssen die Forscher auf invasivere Methoden zurückgreifen, z. B. indem sie einen Teil des darüber liegenden Gewebes entfernen oder winzige optische Geräte, so genannte Mikroendoskope, direkt in das Gehirn stecken. Eine alternative, nicht invasive Methode, um in undurchsichtiges Gewebe zu schauen – bis zu 1 Millimeter tief – ist die Zwei-Photonen-Mikroskopie. Bei dieser Technik wird Licht mit längerer Wellenlänge und geringerer Energie verwendet, das tiefer in das Gewebe eindringen kann. Da Zwei-Photonen-Mikroskope jeweils nur einen einzigen Punkt beleuchten und aufzeichnen, sind die Bilder zu langsam, um einen Großteil der schnellen Vorgänge im Gehirn zu erfassen. Fachleute sind jedoch zuversichtlich, dass Fortschritte in der Technologie es bald ermöglichen werden, die von GEVIs erzeugten Signale mit höherer Geschwindigkeit zu sehen. „Es ist absolut machbar“, sagt Ji.
Wenn die verschiedenen Ansätze diese Herausforderungen überwinden können, haben die Wissenschaftler keinen Zweifel daran, dass die Spannungsbildgebung ein Standardverfahren zur Messung der Gehirnaktivität werden wird. „In den nächsten ein oder zwei Jahren werden wir viele Arbeiten sehen, in denen Spannungssensoren eingesetzt werden und in denen man etwas über die Biologie lernt“, sagt Thomas Clandinin, ein Neurobiologe in Stanford. Einige sagen, dass die Technik sogar Elektroden ersetzen könnte, wenn es darum geht, wie Neuronen Informationen verarbeiten und integrieren.
Forscher im Anfangsstadium sind besonders optimistisch: Hochbaum, der jetzt als Postdoktorand an der Harvard Medical School in Boston arbeitet, sagt, dass GEVIs langfristig ein wichtiges Instrument sein werden, um zu untersuchen, wie verschiedene Kompartimente in der Zelle auf unterschwellige Signale reagieren. Er plant, die Spannungsbildgebung zu nutzen, um zu verstehen, wie solche Signale die Verbindung zwischen Neuronen verändern, ein Schlüsselprozess beim Lernen. Die Möglichkeiten sind aufregend, sagt Hochbaum, aber er hat zumindest eine wichtige Lektion aus den frühen Tagen gelernt, als er vor Freude im Labor herumsprang, wenn er ein Leuchten im Mikroskop sah: Wenn die Experimente funktionieren, sollte man die Feierlichkeiten auf ein Minimum beschränken.