Das allgemeine Ziel dieses Hämagglutinationshemmungstests ist die Messung der Antikörpertiter gegen bestimmte Viren von Interesse. Diese Methode kann zur Beantwortung von Schlüsselfragen im Bereich der Vakzinologie über die impfstoffvermittelte Immunität und den Schutz in verschiedenen Populationen und bei unterschiedlichen Alters- und Patientengruppen beitragen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre Genauigkeit und die Möglichkeit, den Titer von neutralisierenden Antikörpern schnell zu bestimmen.
Obwohl diese Methode Einblicke in menschliche Antikörpertiter gewährt, kann sie auch auf andere Systeme angewandt werden, z. B. auf Antikörpertiter von Mäuseserum oder auf Kulturüberstände. Beschriften Sie zunächst 96-Well-Mikrotiterplatten mit den entsprechenden Versuchsinformationen. Drehen Sie dann die Platte in die vertikale Ausrichtung und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 25 Mikroliter PBS in jede Vertiefung zu geben, außer in die erste Vertiefung der unteren Rücktitrierungsreihe.
Geben Sie 50 Mikroliter der frisch zubereiteten Antigenlösung von Interesse in die erste Vertiefung der Rücktitrierungsreihe, gefolgt von der Zugabe von 25 Mikrolitern der mit RDE behandelten Serumproben in die ersten Vertiefungen der oberen zehn Reihen. In die erste Vertiefung der 11. Reihe werden 25 Mikroliter des entsprechenden Antiserums als positive Kontrolle gegeben. 25 Mikroliter aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in die nachfolgenden Vertiefungen überführen, um serielle zweifache Verdünnungen durchzuführen.
Bei jedem Verdünnungsschritt 10 bis 15 Mal auf- und abpipettieren, wobei die letzten 25 Mikroliter aus den letzten Vertiefungen verworfen werden. Anschließend 25 Mikroliter der Antigenlösung in jede Vertiefung der Reihen 1 bis 11 und 25 Mikroliter PBS nur in jede Vertiefung der hinteren Titrationsreihe geben. Klopfen Sie die Platte vorsichtig 10-mal auf allen vier Seiten, um sie zu mischen.
Dann decken Sie die Platte für 30 Minuten bei Raumtemperatur ab. Am Ende der Inkubation fügen Sie 50 Mikroliter der Erythrozytenlösung in jede Vertiefung hinzu und mischen die Platte durch weiteres Klopfen. Dann die Platte wieder abdecken und die Erythrozyten entsprechend der verwendeten Spezies wie in der Tabelle angegeben inkubieren.
Nach Zugabe der Erythrozyten in die Platte ist die angemessene Inkubationszeit für die im Assay verwendete Blutgruppe einzuhalten. Eine zu kurze oder zu lange Inkubation führt zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse. Am Ende der Inkubation die Hämagglutination beurteilen, indem die Platte 25 Sekunden lang um 90 Grad gekippt wird, und die Ergebnisse für jede Vertiefung, während die Platte noch gekippt ist, auf einem ausgedruckten Schema der 96-Well-Platte markieren.
In diesem Experiment wurde die impfstoffinduzierte Antikörperreaktion bei 26 gesunden Probanden untersucht, die vor der Grippesaison 2015 einen inaktivierten, trivalenten Influenza-Impfstoff mit Influenza A/H1N1/Kalifornien/2009, A/H3N2/Texas/2012 und B/Massachusetts/O2/2012 erhalten hatten. Es wurde eine kreuzreaktive Immunantwort für die Virusstämme A/H3N2/Schweiz/2013 und A/H3N2/Texas/2012 beobachtet, mit deutlich niedrigeren geometrischen mittleren Hämagglutinationshemmungstitern und induzierter Seroprotektion gegen Influenza A/H3N2/Schweiz/2013 im Vergleich zu Influenza A/H3N2/Texas/2012. Nach der Impfung stiegen die Antikörpertiter gegen beide Stämme an, obwohl der Stamm A/H3N2/Schweiz/2013 nicht im Impfstoff enthalten war.
Virales Hämagglutinin weist ein speziesabhängiges Potenzial für die Hämagglutination von Erythrozyten auf. Interessanterweise hämagglutiniert Meerschweinchenblut nicht richtig mit Influenza B, während Truthahnblut das Potenzial für eine Hämagglutination mit hohen Titern und geringer Kreuzreaktivität hat. Wenn dieses Verfahren einmal beherrscht wird, kann es bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Serum mit RDE zu behandeln, um alle unspezifischen Inhibitoren und unspezifischen Bindungen während der Hämagglutination des Virus zu inaktivieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie ELISA durchgeführt werden, um weitere Fragen zur Rolle der einzelnen erregerspezifischen Immunglobuline zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Virusimmunologie den Weg zu einem besseren Verständnis der impfstoffbedingten Immunität bei gesunden und immunsupprimierten Patienten in verschiedenen Altersgruppen.
Nach diesem Video sollten Sie gut verstehen, wie man einen Hämagglutinationshemmungstest durchführt, um Influenzastamm-spezifische Antikörpertiter in großem Maßstab zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Antigenen, tierischem Blut und menschlichen Serumproben extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem BSL2-Labor getroffen werden sollten.