Um die Nutzung von Escher-FBA für reale Anwendungen zu demonstrieren, stellen wir vier wichtige FBA-Beispiele vor, die direkt im Browser ausgeführt werden können. Diese sind einer Übersicht über die FBA und ihre Anwendungen entnommen. Diese Beispiele basieren auf dem Standard-Kernmodell von E. coli, so dass sie sofort nach dem Öffnen der Escher-FBA-Webseite implementiert werden können. Achten Sie darauf, zwischen den Beispielen auf die Schaltfläche Karte zurücksetzen zu klicken. Wenn Sie Probleme haben, eine Reaktion zu finden, klicken Sie einfach auf die Option „Suchen“ im Menü „Ansicht“ (oder auf die Taste „f“ auf Ihrer Tastatur), um eine Suchleiste zu öffnen.
FBA mit alternativen Kohlenstoffsubstraten
Das erste Beispiel demonstriert die Verwendung von FBA, um vorherzusagen, ob Wachstum auf alternativen Kohlenstoffsubstraten stattfinden kann. Das Standard-Kernmodell von E. coli enthält ein simuliertes Minimalmedium mit D-Glucose als Kohlenstoffquelle. Hier werden wir die Kohlenstoffquelle von D-Glukose auf Succinat umstellen. Fahren Sie zunächst mit der Maus über die Succinat-Austauschreaktion EX_succ_e und ändern Sie die untere Grenze auf – 10 mmol/gDW/Std., indem Sie entweder den Schieberegler ziehen oder – 10 in das Feld Lower Bound eingeben. Fahren Sie anschließend mit der Maus über die D-Glucose-Austauschreaktion EX_glc_e und erhöhen Sie entweder die untere Grenze auf 0 oder klicken Sie auf die Schaltfläche Knockout. Das Standardziel ist nach wie vor die Maximierung des Wachstums. Durch diese beiden Änderungen wird das Programm angewiesen, die maximale Wachstumsrate unter Verwendung von Succinat als Kohlenstoffquelle anstelle von D-Glucose zu berechnen. Sie sollten sehen, dass die vorhergesagte maximale Wachstumsrate von 0,874 h-1 auf 0,398 h-1 sinkt, was die geringere Wachstumsausbeute von E. coli auf Succinat widerspiegelt (Abb. 2a). Dies ist der allgemeine Ansatz, um Änderungen in Escher-FBA vorzunehmen; fahren Sie mit der Maus über die Reaktion, nehmen Sie die gewünschten Änderungen vor, und Escher-FBA zeigt Ihre Ergebnisse automatisch an. Die unteren Grenzwerte für den Austausch von Kohlenstoffquellen stellen experimentelle Messungen dar, so dass Sie versuchen können, den spezifischen unteren Grenzwert an realistische Werte für das Wachstum mit anderen Kohlenstoffquellen anzupassen.
Beispiele für Escher-FBA-Simulationen. (a) Simuliertes Wachstum mit Succinat als einziger Kohlenstoffquelle. (b) Simuliertes anaerobes Wachstum auf einem Glukose-Minimalmedium. (c) Maximierung des ATP-Ertrags im Standardmodell. (d) Wachstum des iMM904-Modells von S. cerevisiae. Beachten Sie, dass die Pfeilbreiten im Einstellungsmenü vergrößert wurden, um Änderungen deutlicher zu machen
FBA während des anaeroben Wachstums
Anaerobes Wachstum kann auf die gleiche Weise simuliert werden, indem man mit der Maus über die EX_o2_e-Reaktion fährt und entweder auf Knockout klickt oder die untere Grenze auf 0 ändert. Wenn Sie den Sauerstoffaustausch auf Null ändern, während Succinat immer noch die einzige Kohlenstoffquelle ist, zeigt der Indikator „Flux Through Objective“ „Infeasible solution/Dead cell“ an, was bedeutet, dass ein Wachstum nicht möglich ist. Versuchen Sie, auf die Schaltfläche „Zurücksetzen“ in der rechten unteren Ecke zu klicken, um ein minimales Medium mit D-Glukose als Kohlenstoffquelle zu simulieren, und schalten Sie dann EX_o2_e aus, und die vorhergesagte Wachstumsrate sollte 0,211 h- 1 betragen (Abb. 2b).
FBA mit Verbundzielen
Escher-FBA unterstützt die Einstellung mehrerer Ziele im Modus „Verbundziele“. Im Standardmodell wird durch das Setzen eines neuen Ziels immer das vorherige Ziel deaktiviert. Um den Modus zu aktivieren, klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche Compound Objectives am unteren Rand des Bildschirms. Ein Beispiel für die Verwendung des Modus: Um die maximale Wachstumsrate bei gleichzeitiger Minimierung des Flusses durch SUCDi zu überprüfen, beginnen Sie mit dem Standardziel der Maximierung der Biomasseproduktion. Fahren Sie dann mit der Maus über die Reaktionsbezeichnung für SUCDi und klicken Sie in der QuickInfo auf die Schaltfläche Minimieren. Unten rechts sollten Sie beide Ziele aufgelistet sehen. Beachten Sie, dass derzeit nur Zielkoeffizienten von 1 oder – 1 (dargestellt durch Maximieren und Minimieren) unterstützt werden. Um zu den Einzelzielen zurückzukehren, klicken Sie einfach erneut auf die Schaltfläche Compound Objectives.
Analyse der Stoffwechselausbeuten
Wir können Escher-FBA auch verwenden, um die maximalen Ausbeuten von Vorläufern und Cofaktoren wie ATP zu bestimmen. Alles, was dazu nötig ist, ist eine stöchiometrisch ausgeglichene Reaktion, die den interessierenden Cofaktor verbraucht. Die ATP-Erhaltungsreaktion (ATPM) ist ein solches Beispiel. Um die maximale ATP-Produktion zu bestimmen, fahren Sie einfach mit der Maus über die ATPM-Reaktion und klicken Sie auf die Schaltfläche Maximieren. Die Einstellung des Ziels auf diese Weise funktioniert, weil das System, um den Fluss durch die ATPM-Reaktion zu maximieren, zunächst ATP in der höchstmöglichen Menge produzieren muss. Wenn ATPM im Standard-Kernstoffwechselmodell von E. coli maximiert wird, beträgt der Zielwert 175 mmol/gDW/hr. (Abb. 2c). Mit Succinat als Kohlenstoffquelle sinkt dieser Wert auf 82,5 mmol/gDW/hr. Das gleiche Verfahren kann für jeden Metaboliten von Interesse angewandt werden, indem man eine stöchiometrisch ausgeglichene Verbrauchsreaktion erstellt und das Modell so einstellt, dass der Fluss durch diese Reaktion maximiert wird. Beachten Sie, dass es derzeit nicht möglich ist, eine solche Reaktion automatisch in Escher-FBA zu erstellen, aber dies kann in einer zukünftigen Version hinzugefügt werden.
Flussvariabilitätsanalyse
Die Analyse alternativer optimaler Lösungen im Stoffwechsel ist eine weitere nützliche Anwendung von FBA . Da die durch FBA erzeugten Lösungen oft nicht eindeutig sind, kann es nützlich sein, den Bereich der Flusswerte zu kennen, die eine bestimmte Reaktion haben kann. Die Analyse der Flussvariabilität (FVA) wird häufig verwendet, um diese Bereiche für das gesamte Netzwerk zu berechnen. Escher-FBA unterstützt die FVA-Berechnungen nicht direkt, aber es ist möglich, sie für eine bestimmte Reaktion zu berechnen. Gehen Sie dazu zunächst mit der Maus auf die Zielfunktion (die Biomassereaktion Biomass_Ecoli_core_w_GAM) und setzen Sie die obere und untere Grenze auf einen Wert, der etwas unter dem aktuellen Flusswert liegt (in der Standardkarte versuchen Sie es mit 0,870). Klicken Sie dann mit der Maus auf eine Reaktion von Interesse und klicken Sie auf die Schaltflächen Maximieren und Minimieren, um den maximalen und minimalen Fluss durch diese Reaktion bei optimaler Wachstumsrate anzuzeigen. Die Maximierung und Minimierung des Flusses durch GAPD in der Glykolyse ergibt beispielsweise einen möglichen Flussbereich von 15,44-16,68 mmol/gDW/Std., was darauf hinweist, dass der glykolytische Fluss bei hohen Wachstumsraten stark eingeschränkt ist. Andererseits ergibt die Maximierung und Minimierung des Flusses durch MALS im Glyoxylat-Shunt einen machbaren Flussbereich von 0-2,64 mmol/gDW/Std., was darauf hindeutet, dass der Glyoxylat-Shunt bei hohen Wachstumsraten aktiviert oder inaktiv sein kann. Dieses Verfahren kann mit jedem Satz von Reaktionen durchgeführt werden, und der Benutzer kann sein System auf eine beliebige Anzahl von Flusswerten einschränken, um den Bereich der für eine bestimmte Reaktion verfügbaren Lösungen zu sehen.
Verwendung anderer Modelle im Genom-Maßstab
Das Standard-E.coli-Kernmodell ist nicht das einzige System, das simuliert werden kann. Wenn man zum Beispiel Simulationen mit einer Hefezelle durchführen möchte, kann man ein Modell und eine Karte für Saccharomyces cerevisiae von http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904 herunterladen. Auf dieser Seite klicken Sie auf die Schaltfläche zum Herunterladen des Modells (iMM904.json) und der Karte (iMM904.Central carbon metabolism.json). Laden Sie diese in Escher-FBA, indem Sie im Menü Karte auf Karte JSON laden und im Menü Modell auf Modell JSON laden klicken, um beide JSON-Dateien zu laden. Sobald die Karte geladen ist, kann sie mit einem der Werkzeuge in Escher oder Escher-FBA bearbeitet und simuliert werden (Abb. 2d). Bei einem größeren Modell wie iMM904 sind nicht alle Reaktionen auf einmal sichtbar, aber Sie können eine Reaktion zur Visualisierung hinzufügen. Klicken Sie zunächst entweder auf das Schraubenschlüssel-Symbol in der Seitenleiste oder wählen Sie im Menü Bearbeiten die Option Reaktionsmodus hinzufügen. Nun können Sie Reaktionen hinzufügen, indem Sie auf eine beliebige Stelle der Karte klicken und die gewünschte Reaktion aus dem Dropdown-Menü auswählen. Das Texteingabefeld kann verwendet werden, um nach einer Reaktion von Interesse zu suchen.
Anwendung von Escher-FBA für das Design mikrobieller Zellfabriken
Um ein Beispiel für eine Forschungshypothese zu liefern, die mit Escher-FBA getestet werden kann, haben wir Modelle von E. coli im Genom-Maßstab geladen, die zwei Wege zur Herstellung von 1-Propanol für die chemische Produktion enthalten. Diese Wege wurden kürzlich in einer Studie über die Vorhersagekraft von Modellen im Genom-Maßstab für die Simulation realer mikrobieller Zellfabrikstämme analysiert. Das erste Modell umfasst einen einzigen Weg zur Herstellung von 1-Propanol (Additional file 1), der zuerst von Atsumi et al. berichtet wurde. Das zweite Modell umfasst zwei synergistische Wege für die 1-Propanol-Produktion (Additional file 2), die zuerst von Shen und Liao beschrieben wurden. Jedes Modell kann separat geladen werden (mit der Menüschaltfläche Modell > COBRA-Modell laden JSON), und es wird eine einzige Karte des zentralen Stoffwechsels bereitgestellt, die mit beiden Modellen kompatibel ist (Zusätzliche Datei 3, kann mit Karte > Karte laden JSON geladen werden).
Wir waren neugierig, ob der synergistische Ansatz für die 1-Propanol-Produktion – der bekanntermaßen eine höhere Produktionsausbeute hat – auch einen Unterschied in der erforderlichen Nutzung der Wege aufweist. Daher luden wir jedes Modell einzeln, maximierten die Ausscheidung von 1-Propanol (fuhren mit dem Mauszeiger über EX_1poh_e und klickten auf Maximieren), setzten die untere Grenze für die Ausscheidung auf 99 % des Maximums und minimierten dann den Fluss durch den ersten Schritt des Pentosephosphatwegs, die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH2r). Die resultierenden Karten zeigen, dass die synergistischen Wege für die 1-Propanol-Produktion stöchiometrisch mit der Glykolyse ausgeglichen sind, so dass sie keine PPP-Aktivität erfordern (Abb. 3b). Andererseits erfordert der Einzelweg einen erheblichen PPP-Fluss (Abb. 3a). Andere Wege, wie z. B. der jeweils notwendige TCA-Fluss, können ebenfalls auf diesen Karten untersucht werden.
Wegnutzung für zwei heterologe Wege zur 1-Propanol-Produktion in E. coli. Der für jeden heterologen Produktionsweg erforderliche Fluss über den Pentosephosphatweg (PPP) kann verglichen werden, indem erstens die Produktion von 1-Propanol auf 99 % des Maximalwerts gezwungen wird (indem die untere Grenze der 1-Propanol-Austauschreaktion festgelegt wird) und zweitens der Fluss durch den ersten Schritt im PPP minimiert wird. (a) Der von Atsumi et al. beschriebene 1-Propanol-Weg nutzt einen einzigen Weg, um 1-Propanol zu produzieren. Er erfordert einen erheblichen PPP-Fluss und hat einen geringeren Gesamtertrag. (b) Der von Shen und Liao beschriebene Weg nutzt zwei Wege synergetisch, um einen höheren Ertrag zu erzielen. Der Stoffwechselweg ist stöchiometrisch mit der Glykolyse ausgeglichen, so dass kein PPP-Fluss erforderlich ist
Während Escher-FBA bereits für viele FBA-Simulationen direkt im Webbrowser verwendet werden kann, können einige der von Orth et al. vorgestellten Beispiele derzeit nicht mit Escher-FBA durchgeführt werden. So kann Escher-FBA derzeit keine Funktionen wie Gen-Knockout-Analyse oder Robustheitsanalyse durchführen. Allerdings verwendet Escher-FBA flexible SVG-Darstellungen für visuelle Elemente, so dass Robustheitsanalysen und sogar grafische Funktionen wie Phasenebenen hinzugefügt werden könnten. Wir haben eine Entwicklungs-Roadmap für Escher-FBA (verfügbar auf der Homepage https://sbrg.github.io/escher-fba) und einen iterativen Entwicklungsprozess erstellt, um schließlich komplexe systembiologische Analysen im Webbrowser zu ermöglichen.