Studienpopulation
Diese Untersuchung basiert auf den HAPIEE-Kohorten (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) aus Polen, der Tschechischen Republik und Litauen sowie dem 8-Jahres-Follow-up der deutschen ESTHER-Kohorte (deutsche Bezeichnung: „Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung“).
Die gesamte HAPIEE-Studie umfasst Kohorten in vier Ländern. Da es nicht möglich war, Blutproben aus Russland zu exportieren, wurden nur drei Kohorten in die aktuelle Analyse einbezogen. Die Studienteilnehmer wurden in sechs tschechischen Städten (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec und Usti nad Labem) in den Jahren 2002-2005 (n = 8.857), in Krakau, Polen, in den Jahren 2002-2005 (n = 10.728) und in Kaunas, Litauen, in den Jahren 2006-2008 (n = 7.161) rekrutiert. Jede Kohorte besteht aus einer Zufallsstichprobe von Männern und Frauen, die zu Beginn der Studie 45-75 Jahre alt waren, geschichtet nach Geschlecht und 5-Jahres-Altersgruppen, ausgewählt aus Bevölkerungsregistern. Die allgemeine Rücklaufquote betrug 61 %. Die Daten wurden mit Hilfe eines Fragebogens und einer kurzen Untersuchung in einer Klinik erhoben, bei der eine venöse Nüchternblutprobe entnommen wurde.
Die ESTHER-Studie ist eine bevölkerungsbezogene Kohorte von 9.949 Erwachsenen, die zu Studienbeginn zwischen 50 und 74 Jahre alt waren und zwischen 2000 und 2002 von ihren Hausärzten im Rahmen einer routinemäßigen Gesundheitsuntersuchung im Saarland rekrutiert wurden. Die aktuelle Untersuchung basiert auf der 8-jährigen Nachbeobachtung, die zwischen Juli 2008 und Dezember 2010 durchgeführt wurde und bei der die Studienteilnehmer zwischen 56 und 85 Jahre alt waren. Von der Erstuntersuchung bis zum 8-Jahres-Follow-up waren 499 Personen verstorben, 505 Personen waren aufgrund ihres schlechten Gesundheitszustands nicht mehr in der Lage, an der Studie teilzunehmen, und 680 Personen hatten eine weitere Teilnahme abgelehnt. Von den verbleibenden 8 265 Teilnehmern schickten 6 061 einen Fragebogen zurück (Rücklaufquote 73,4 %) und 4 637 spendeten eine Blutprobe in der Praxis ihres Hausarztes. Die Hausärzte der Studienteilnehmer füllten außerdem einen Fragebogen zum Gesundheitszustand der Studienteilnehmer aus (verfügbar für n = 5.997). Darüber hinaus stimmten 3.124 Studienteilnehmer einer zusätzlichen dreistündigen geriatrischen Untersuchung zu, die von Studienärzten bei den Teilnehmern zu Hause durchgeführt wurde.
Die Variablen in den ESTHER- und HAPIEE-Studien wurden harmonisiert und die Marker für oxidativen Stress wurden im Rahmen des Consortium on Health and Ageing gemessen: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu) gemessen, das an anderer Stelle beschrieben wurde. Die Studien wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt, und von allen Studienteilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
Ethik, Einwilligung und Genehmigungen
Die eingeschlossenen Studien wurden von den jeweiligen lokalen Ethikkommissionen genehmigt (ESTHER: Medizinische Fakultät der Universität Heidelberg und Ärztekammer des Saarlandes; HAPIEE: University College London (Großbritannien), National Institute of Public Health (Prag, Tschechische Republik), Jagiellonian University (Krakau, Polen) und Litauische Universität für Gesundheitswissenschaften (Kaunas, Litauen)). Von allen Teilnehmern der untersuchten Studien wurde die schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt, und die Studien wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.
Bewertung der Kovariaten
In den ESTHER- und HAPIEE-Studien wurden soziodemografische Daten, Daten zum Lebensstil und zur Krankheitsgeschichte mit Hilfe von selbst ausgefüllten Fragebögen erfasst. Größe und Gewicht wurden gemessen und in der ESTHER-Studie bei denjenigen Studienteilnehmern, die dem Hausbesuch nicht zugestimmt hatten, durch Selbstauskünfte ergänzt. Zusätzlich zu den Selbstauskünften wurde die Anamnese häufiger chronischer Krankheiten in der ESTHER-Studie durch Einsichtnahme in die Krankenakte oder das saarländische Krebsregister validiert. Eine Nierenfunktionsstörung wurde durch eine geschätzte glomeruläre Filtrationsrate <60 ml/min/1,73 m2 definiert, die mit der Kreatinin-basierten Gleichung der Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration berechnet wurde. In der ESTHER-Kohorte wurden die Serumkreatininkonzentrationen mit einer kinetischen Jaffé-Methode auf einem Cobas 8000 C701 (Analyte: CREJ2 3000, Roche) bestimmt. Gesamtcholesterin und High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL) wurden in Serumproben durch enzymatische Chromatographie (Analyten: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) und C-reaktives Protein (CRP) durch Immunturbidimetrie auf dem Cobas 8000 C701 (Analyten: CRPL3 500, Roche) bestimmt. In der HAPIEE wurden Gesamt- und HDL-Cholesterin ebenfalls mit derselben Testmethode und Roche-Analyten bestimmt, aber es wurden unterschiedliche Autoanalyzer verwendet (HAPIEE Tschechische Republik und Litauen: Roche Cobas Mira; HAPIEE Polen: Hitachi 917/Modular P). Darüber hinaus wurden in allen HAPIEE-Kohorten Serumkreatinin und CRP mit derselben Assay-Methode wie in ESTHER bestimmt, jedoch mit Analyten eines anderen Anbieters (Beckman-Coulter) und auf einem anderen Autoanalyzer (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).
Mortalitätserfassung
Für diese Analysen wurde die Gesamtmortalität durch offizielle landesweite (Tschechische Republik, Deutschland), lokale (Litauen) oder regionale Sterberegister (Polen) bis zum 31. Dezember 2010 in Polen, bis zum 31. Dezember 2011 in der Tschechischen Republik und Litauen und bis zum 31. Juli 2014 in Deutschland erfasst. Die ursachenspezifische Mortalität in Deutschland war nur für Todesfälle verfügbar, die bis zum 2. April 2013 eingetreten waren. Die Register waren für alle Teilnehmer vollständig, die nicht aus dem Erfassungsgebiet des Registers weggezogen waren. Der Verlust der Nachbeobachtung aufgrund von Migration betrug 4 % in den HAPIEE-Kohorten (kombiniert) und 2 % in der ESTHER-Studie. Alle Todesfälle, die mit den ICD-10-Codes I00-I99 kodiert wurden, galten als kardiovaskuläre Todesfälle, und Krebstodesfälle wurden durch die ICD-10-Codes C00-C97 definiert.
Messung der Serummarker für oxidativen Stress
Die zur Messung der d-ROMs-Konzentration (Diacron, Grosseto, Italien) und der TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Türkei) verwendeten Assays wurden im Labor für Gesundheitsschutzforschung (Bilthoven, Niederlande) an einen Autoanalyzer (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Niederlande) angepasst, wie zuvor beschrieben. Der d-ROMs-Assay misst die Hydroperoxidkonzentration in Carratelli-Einheiten (Carr U), benannt nach dem Erfinder des Assays, Mauro Carratelli. Jede Carr U entspricht 0,08 mg Wasserstoffperoxid (H2O2)/100 mL in der Probe. Der TTL-Assay misst die Konzentration freier Thiolgruppen in der Probe in μmol/L.
Die Messungen wurden in Serumproben durchgeführt, die etwa 3-10 Jahre in Gefrierschränken bei -80 °C gelagert wurden. d-ROMs und TTL haben unter diesen Bedingungen eine gute Langzeitstabilität . In der 8-Jahres-Follow-up-Studie von ESTHER wurden d-ROMs und TTL bei allen Teilnehmern gemessen, die bei ihrem Hausarzt Blutproben gespendet hatten (n = 4 637). Die Messungen wurden jedoch zu zwei verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, da die Finanzierung für die Messung aller Proben in der im Juni 2012 durchgeführten Pilotstudie nicht möglich war. Zur Korrektur möglicher Verschiebungen in den Assays wurden 80 Proben von Zeitpunkt 1 (Juni 2012) zu Zeitpunkt 2 (September 2014) erneut gemessen und lineare Regressionsgleichungen erstellt, die zur Standardisierung der Ergebnisse von Zeitpunkt 2 auf die Werte von Zeitpunkt 1 verwendet wurden, als die Messungen in den HAPIEE-Kohorten ebenfalls stattfanden (während des gesamten Jahres 2012). Die Übereinstimmung der d-ROMs-Messungen war hoch (Spearman-Korrelationskoeffizient r = 0,92 und Mittelwertdifferenz = 15 Carr U), weshalb keine Korrekturen vorgenommen wurden. Bei TTL wurde eine offensichtliche Verschiebung der Testergebnisse (r = 0,88 und Mittelwertdifferenz = 81 μmol/L) durch Anwendung der folgenden Gleichung auf alle Messungen von Zeitpunkt 2 korrigiert: TTL-Zeitpunkt2 = 0,746 × TTL-Zeitpunkt1. Darüber hinaus schlossen wir 610 Messungen in Blutproben aus, die die strengen Qualitätskriterien für Hämolyse, Ikterus und Lipämie in der ESTHER-Studie nicht erfüllten, so dass 4 027 für die Analyse in der vorliegenden Studie übrig blieben. In den HAPIEE-Kohorten war die Zahl der Proben, die diese Qualitätskriterien nicht erfüllten, vernachlässigbar.
Analytische Studienprobe
Aufgrund begrenzter finanzieller Mittel wurden die d-ROMs-Werte und die TTL nicht bei allen Teilnehmern der HAPIEE-Kohorten gemessen; stattdessen wurde ein abgestimmtes Fall-Kontroll-Design gewählt (Additional file 1: Abbildung S1). Als Fälle wurden alle Probanden definiert, die während der Nachbeobachtung verstarben (n = 1.433) oder einen nicht tödlichen Myokardinfarkt (MI) oder Schlaganfall erlitten (n = 658). Die Kontrollpersonen (n = 4 396) wurden nach Geschlecht und 5-Jahres-Altersgruppen mit den Fällen abgeglichen. Um die Überstichprobe für MI und Schlaganfall in dieser Mortalitätsanalyse zu korrigieren, wurden in einem ersten Schritt Personen mit nicht tödlichem MI oder nicht tödlichem Schlaganfall während der Nachbeobachtung von den Fällen ausgeschlossen. Um eine repräsentative Stichprobe von Probanden mit nicht-tödlichen MI- oder Schlaganfallereignissen zu den Kontrollen hinzuzufügen, wurde in einem zweiten Schritt der beobachtete Anteil der nicht-tödlichen MI- oder Schlaganfallereignisse in jeder alters- und geschlechtsspezifischen Schicht der Gesamtkohorte berechnet. In einem dritten Schritt wurden diese Anteile mit den Stichprobengrößen in jeder Schicht der Kontrollen mit gemessenen oxidativen Stressmarkern multipliziert. In einem vierten Schritt wurden die sich daraus ergebenden Zahlen in jeder Schicht zufällig aus der Gruppe der Probanden mit nicht tödlichem MI oder Schlaganfall ausgewählt und zu den Kontrollen hinzugefügt, so dass sich ein Pool von 4.552 in Frage kommenden Kontrollen für die 1.433 Todesfälle ergab. Im letzten Schritt wurde der Pool der in Frage kommenden Kontrollen verwendet, um jedem Todesfall individuell genau zwei Kontrollen nach Kohorte, Geschlecht und Alter (±5 Jahre) zuzuordnen.
Statistische Analysen
Unterschiede in den Ausgangsmerkmalen zwischen Fällen (Tod während der Nachbeobachtung) und Kontrollen wurden mit dem χ2-Test für kategorische Variablen und dem Wilcoxon-Rangsummentest für kontinuierliche Variablen bewertet. Querschnittsassoziationen zwischen etablierten Risikofaktoren für die Sterblichkeit und hohen oxidativen Stresswerten wurden mit logistischen Regressionsmodellen bewertet, die alle Ausgangsmerkmale als kategoriale Variablen modellierten (Tabelle 1). Die abhängige Variable „hoher oxidativer Stress“ wurde durch zwei verschiedene Definitionen auf der Grundlage von d-ROMs-Werten oder TTL definiert. Für d-ROMs wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers ein klinischer Cut-off-Wert von >400 Carr U verwendet, der 23 % der ESTHER-Kohorte und 30 % der in Frage kommenden Kontrollen der HAPIEE-Kohorte in die Kategorie „hoher“ oxidativer Stress einordnete. Für TTL sind keine klinischen Grenzwerte verfügbar, und da der Test noch nicht standardisiert ist, variierten die Mittelwerte der Bevölkerung zwischen den Kohorten stark. Um den Anteil der Personen mit hohem oxidativem Stress anzugleichen, der sich aus der Definition auf der Grundlage der d-ROMs-Werte ergibt, wurde daher das unterste kohortenspezifische TTL-Quartil (25 %) verwendet, um die Probanden auf der Grundlage von TTL in eine Kategorie mit hohem oxidativem Stress einzustufen. Die Querschnittsanalysen wurden bei allen Probanden und getrennt für Frauen und Männer durchgeführt.
Für Längsschnittanalysen, Die Cox-Proportional-Hazard-Regression (ESTHER-Kohorte) und die bedingte logistische Regression (HAPIEE-Fall-Kontroll-Studie) wurden zur Schätzung von Hazard Ratios bzw. Odds Ratios für einen Anstieg der d-ROMs-Werte und eine Abnahme der TTL um eine kohortenspezifische Standardabweichung (SD) verwendet. Darüber hinaus wurden die d-ROMs-Werte auch als kategorische Variable modelliert, wobei die vom Hersteller empfohlenen klinischen Grenzwerte für mäßigen (341-400 Carr U), hohen (401-500 Carr U) und sehr hohen oxidativen Stress (>500 Carr U) im Vergleich zu Probanden mit nicht erhöhtem oder niedrigem oxidativen Stress (≤340 Carr U) verwendet wurden. Wenn das absolute Risiko gering ist, führen die logistische und die Cox-Regression in der Regel zu ähnlichen Ergebnissen, und das Odds Ratio kann als Annäherung an das genauere Hazard Ratio betrachtet werden. Wir haben für beide Effektschätzungen den Begriff relatives Risiko (RR) verwendet. In einer Sensitivitätsanalyse wurden Analysen zur ursachenspezifischen Mortalität in der ESTHER-Kohorte unter Berücksichtigung des konkurrierenden Risikos des Todes aufgrund anderer Ursachen durchgeführt, indem ein proportionales Unterverteilungs-Hazards-Regressionsmodell mit Gewichten für Probanden, die das konkurrierende Risikoereignis erlitten haben, gemäß einer Erweiterung der Fine-and-Gray-Methode angepasst wurde. Die Ergebnisse waren jedoch fast identisch mit der traditionellen Cox-Proportional-Hazard-Regression, weshalb in diesem Manuskript nur die letzteren Ergebnisse dargestellt werden.
Die Analysen wurden für jede Kohorte getrennt durchgeführt und durch eine Meta-Analyse mit Mantel-Haenszel-Gewichtung und Zufallseffekten gepoolt, wobei der Stichprobenumfang der Kohorten und die Möglichkeit einer statistischen Heterogenität zwischen den Studien berücksichtigt wurden. Letztere wurde mit dem Q-Test von Cochrane und der I2-Statistik untersucht.
Die folgenden Ergebnisse wurden analysiert: Sterblichkeit aufgrund aller Ursachen, CVD, Krebs und Nicht-CVD, Nicht-Krebs-Ursachen. Für jedes Ergebnis wurden vier statistische Modelle entwickelt, wobei zunehmend etablierte Mortalitätsrisikofaktoren in die Modelle einbezogen wurden. Sowohl die d-ROMs-Werte als auch die TTL wurden immer in dasselbe Modell aufgenommen, da ihre Korrelation gering war (r <0,08 in jeder Kohorte). In Modell 1 wurde in der ESTHER-Kohorte eine Anpassung für Alter und Geschlecht vorgenommen, während dies für die HAPIEE-Kohorten nicht erforderlich war, da die Fälle individuell mit zwei Kontrollen nach Alter und Geschlecht gematcht und in einer stratifizierten Analyse analysiert wurden, bei der die Schichten aus der Sammlung der gematchten Gruppen bestehen. Modell 2 wurde zusätzlich um Bildung, Body-Mass-Index (BMI), Rauchen, Alkoholkonsum und körperliche Aktivität bereinigt. In Modell 3 wurden auch Krankheiten berücksichtigt, die potenziell den Zusammenhang zwischen oxidativem Stress und Mortalität vermitteln könnten (d. h. Dyslipidämie (gemessen am Gesamt- und HDL-Cholesterin), Nierenfunktionsstörungen, Diabetes in der Vorgeschichte, Bluthochdruck, Herzinfarkt, Schlaganfall und Krebs). Schließlich wurde Modell 4 zusätzlich um die CRP-Werte bereinigt, die stark mit den d-ROMs-Werten (r = 0,34-0,41 in den Kohorten) und weniger stark mit TTL (r = 0,11-0,17 in den Kohorten) korreliert waren. Das Alter wurde als kontinuierliche Variable modelliert, alle anderen Variablen wurden als kategoriale Variablen modelliert (die Kategorien sind in Tabelle 1 aufgeführt). Wir testeten auf Wechselwirkungen zwischen d-ROMs/TTL und Kovariaten, indem wir geeignete Interaktionsterme zu Modell 2 hinzufügten.
Die zu analysierenden Untergruppen wurden a priori mit dem Ziel ausgewählt, nach den wichtigsten potenziellen Determinanten hoher oxidativer Stresswerte zu stratifizieren: Kohorte/Land, Alter, Geschlecht, Vorgeschichte von MI oder Krebs und Entzündungsstatus. Aufgrund der begrenzten Stichprobengröße beschränkten sich die stratifizierten Analysen auf die Sterblichkeit aller Ursachen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs. Um die Möglichkeit einer Verzerrung durch umgekehrte Kausalität auszuschließen, wurden die Analysen getrennt für Ereignisse durchgeführt, die in den Jahren 1-2, 3-4 und 5-6 der Nachbeobachtungszeit auftraten. Aufgrund der begrenzten Stichprobengröße konnte diese stratifizierte Analyse nur für die Gesamtmortalität durchgeführt werden. Um eine Modellinstabilität zu vermeiden, wurde das Ergebnis einer kohortenspezifischen Untergruppenanalyse nur dann für die Metaanalyse berücksichtigt, wenn mindestens 25 Ereignisse in der Untergruppe auftraten.
Mehrfache Imputation wurde angewandt, um die Anzahl der fehlenden Werte für die Grundlinie der Kovariaten zu imputieren, die in Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt sind. Der Anteil der fehlenden Werte lag bei allen Variablen unter 5 %, mit Ausnahme des Alkoholkonsums und der körperlichen Aktivität, bei denen bis zu 22 % der Werte fehlten. Nach unserem besten Wissen fehlten die Daten nach dem Zufallsprinzip, was der Annahme der multiplen Imputation entspricht. Getrennt nach Kohorte, Fallstatus und Geschlecht wurden 20 vollständige Datensätze mit der SAS 9.3-Prozedur „PROC MI“ unter Verwendung der Markov-Chain-Monte-Carlo-Methode imputiert. Für das Imputationsmodell wurden Variablen aus dem „vollständigen“ Modell verwendet. Alle multivariablen Analysen wurden in den 20 imputierten Datensätzen durchgeführt, und die Ergebnisse der einzelnen Datensätze wurden mit der SAS 9.3-Prozedur „PROC MIANALYZE“ kombiniert.
Die Meta-Analysen wurden mit der statistischen Software Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA) durchgeführt. Alle anderen Analysen wurden mit SAS, Version 9.2 (Cary, North Carolina, USA) durchgeführt. Alle statistischen Tests waren zweiseitig und verwendeten ein Alpha-Niveau von 0,05.