Tabelle 1
Anregung, Emission und Helligkeit
Wenn Sie mehrere fluoreszierende Markierungen verwenden wollen, ist es wichtig, eine mit eindeutigen Emissionspeaks zu wählen – sowie mit Anregungspeaks, die Sie mit den verfügbaren Lasern ansteuern können. Wenn sich die Emissionspeaks überschneiden, ist es schwierig oder sogar unmöglich, sie zu unterscheiden.
In der Regel wollen Sie den hellsten Fluoreszenzmarker innerhalb der verfügbaren Spektren verwenden, um ein deutliches Signal zu erhalten und eine mögliche Hintergrundfluoreszenz zu überwinden. Die Helligkeitswerte sind ein Produkt aus dem Extinktionskoeffizienten des Proteins und der Quantenausbeute. Die sich daraus ergebende Zahl kann jedoch schwer zu interpretieren sein, daher ist die Helligkeit eines fluoreszierenden Tags im Verhältnis zu einem gut definierten Tag, wie EGFP, ein gängiges alternatives Maß.
Reifung und Ausbleichen
Die Reifung definiert, wie lange ein fluoreszierender Tag braucht, um sich korrekt zu falten, das Chromophor zu bilden und zu fluoreszieren. Für zeitkritische Ereignisse in lebenden Zellen kann eine kurze Reifungszeit wichtig sein. Superfolder GFP (sfGFP) kann sich beispielsweise in weniger als 10 Minuten falten, während mOrange mehr als vier Stunden braucht.
Das Ausbleichen ist ein Maß für die Photostabilität, d. h. wie lange das Chromophor nach der Anregung die Fähigkeit verliert, Licht zu emittieren. Wenn Sie längere Zeitrafferexperimente durchführen wollen, sollten Sie einen Tag mit hoher Photostabilität wählen. T-Saphir hat eine Bleichhalbwertszeit (t½; Zeit, die vergeht, bis eine anfängliche Emissionsrate von x Photonen/s auf die Hälfte reduziert ist) von 25 Sekunden, EGFP ist jedoch mit einer Bleichhalbwertszeit von 174 Sekunden wesentlich stabiler.
Umgebungsbedingungen
Wie die meisten Proteine werden auch fluoreszierende Marker durch pH-Wert, Temperatur und Sauerstoffgehalt beeinflusst. Je nach der Umgebung, die Sie verwenden möchten, müssen Sie entweder die Bedingungen geringfügig anpassen oder ein geeigneteres Tag auswählen.
Der pH-Wert kann sich auf die Anregungs- und Emissionsspitzen auswirken, und die meisten Fluoreszenz-Tags sind säureempfindlich: Einige können bei pH-Änderungen sogar ihre Fluoreszenzintensität ändern (z. B. pHTomato). Der pKa-Wert ist ein guter Indikator für die pH-Empfindlichkeit, da er den pH-Wert angibt, bei dem die Hälfte der Chromophore fluoresziert.
Außerdem wirken sich sowohl die Temperatur als auch der Sauerstoffgehalt auf die Reifungszeiten aus: Hypoxische Bedingungen verzögern die Reifungszeiten tendenziell, ebenso wie Temperaturen, die außerhalb des optimalen Bereichs der fluoreszierenden Marker liegen (z. B. wurde EGFP für eine Temperatur von 37 °C optimiert). Neuere fluoreszierende Tags wie UnaG, ein GFP, das aus dem japanischen Süßwasseraal (Anguilla japonica) isoliert wurde, fluoresziert jedoch auch bei niedrigem Sauerstoffgehalt3.
Codon-Optimierung
Da die meisten fluoreszierenden Tags von Quallen- oder Korallenproteinen abgeleitet werden und nicht von Säugetierzellen und -geweben, in denen sie wahrscheinlich verwendet werden, kann es bei den verwendeten Aminosäure-Codons Unterschiede zwischen den Arten geben. Dies kann zu einer schlechten Expression und damit zu einem geringen Signal führen.
Glücklicherweise sind viele der neueren Versionen von fluoreszierenden Markern für die Codons optimiert worden, um die Präferenzen von Säugetierzellen zu berücksichtigen. Bei GFP zum Beispiel haben Jürgen Haas und Kollegen das Signal um das 40- bis 120-fache verbessert, indem sie die GFP-Codon-Sequenz modifiziert haben4.
Wenn Sie ein älteres Plasmid zur Herstellung Ihrer Fusionsproteine verwenden, enthält es möglicherweise keine modifizierte Fluoreszenz-Tag-Sequenz. Prüfen Sie daher immer, ob Ihre Sequenz für die Verwendung in einer bestimmten Spezies modifiziert wurde.
Oligomerisierung
Es ist wichtig festzustellen, ob Ihr Tag ein Monomer oder ein Dimer ist (Monomere werden in der Regel durch ein „m“ vor dem Proteinnamen gekennzeichnet, z. B. mCherry) und ob dies Ihr Experiment beeinflusst oder nicht. Viele der frühen fluoreszierenden Marker neigten dazu, Oligomere zu bilden, und die Oligomerisierung kann die biologische Funktion des Fusionsproteins beeinträchtigen. EGFP zum Beispiel ist ein Monomer, das bei hohen Konzentrationen Dimere bilden kann, die subzelluläre Organellen5 verzerren oder Experimente wie FRET6 stören können. In den allermeisten Fällen werden wirklich monomere FPs empfohlen.
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