Kinetisch begrenzte differentielle Zentrifugation als kostengünstige und leicht verfügbare Alternative zur zentrifugalen Abtrennung

In vielen Anwendungen ist die Abtrennung von Zielzellen aus Mischungen erwünscht, die andere Zellen mit ähnlicher Dichte, aber unterschiedlicher Größe (entweder geringfügig oder erheblich) enthalten. Beispiele hierfür sind die Erzeugung synchronisierter Zellkulturen, bei denen Zellen in einem bestimmten Stadium ihres Zyklus (charakterisiert durch ihre Größe) isoliert werden (1-2), die Isolierung von Kortikotropen von anderen Hypophysenzellen (3) und die Sortierung verschiedener Unterpopulationen von Monozyten (4). Die Methode der Wahl für die Trennung von Zellpopulationen auf der Grundlage von Unterschieden in der Sedimentationsgeschwindigkeit (vor allem, wenn die Dichteunterschiede nicht signifikant sind) ist ein Verfahren, das als Zentrifugal-Elutriation bezeichnet wird (5). Dabei werden die Separanden (in der Regel Zellen) zwei Kräften ausgesetzt: (i) einer Zentrifugalkraft, die sie mit einer Geschwindigkeit sedimentieren lässt, die von ihrer Dichte und Größe abhängt, und (ii) einer konvektiven Strömung in die entgegengesetzte Richtung, die allen Zellen eine feste Geschwindigkeit verleiht. Der Fluss und/oder die Zentrifugationsgeschwindigkeit können so eingestellt werden, dass nur die Zellen gesammelt werden, deren Sedimentationsgeschwindigkeit in einen bestimmten Bereich fällt. Obwohl dieses Verfahren auch erfolgreich zur Abtrennung von Bakterienzellen aus Matrices, in denen sie vorhanden sind, eingesetzt wurde (6) (unsere Anwendung von Interesse), stellt die Notwendigkeit einer speziellen Ausrüstung für viele Labors ein Hindernis dar.

Es gibt zwar eine Reihe von Protokollen, die für die Isolierung von Bakterien aus verschiedenen Matrices wie Lebensmitteln (7-8), Erde (9) und mikrobiellen Matten (10) beschrieben wurden und bei denen leicht verfügbare Tischzentrifugen zur Trennung von Zellen auf der Grundlage unterschiedlicher Sedimentationsgeschwindigkeiten eingesetzt werden, doch scheinen die empfohlenen Protokolle oft ad hoc zu sein. So empfahlen Wang et al. (8) bei der Isolierung von Bakterien aus Weichkäse eine Zentrifugation bei <1000×g für eine nicht näher spezifizierte Zeit, um Trümmer zu entfernen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 9000×g für 3 Minuten, um Bakterien zu sammeln. In ähnlicher Weise empfahlen Neiderhauser et al. (7) für die Isolierung von Bakterien aus homogenisiertem Fleisch eine Zentrifugation bei 100×g (für eine nicht spezifizierte Dauer), um Lebensmittelpartikel zu entfernen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3000×g (wiederum für eine nicht spezifizierte Dauer), um Bakterien zu sammeln. In anderen Fällen umfassen die empfohlenen Protokolle mehrere Zentrifugationsrunden. So empfehlen Bey et al. (10) zur Isolierung von Bakterien aus mikrobiellen Matten nicht nur eine 15-minütige Zentrifugation bei 500×g, sondern auch eine Resuspension des Sediments und eine viermalige Wiederholung des Verfahrens. In ähnlicher Weise empfiehlt Bakken (9) für die Isolierung von Bakterien aus dem Boden eine wiederholte Zentrifugation des Probenhomogenats bei 630-1060×g (für eine nicht näher spezifizierte Zeitspanne), gefolgt von einer Resuspension und einer erneuten Homogenisierung. Ähnliche Verfahren wurden auch für die Isolierung von Bakterien aus „positiven“ Blutkulturbrühen vorgeschlagen. Zur Gewinnung reiner Bakterienisolate vor der Identitätsbestimmung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie verwendeten Stevenson et al. (11) ein mehrstufiges Zentrifugationsverfahren mit aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten von jeweils „1-2 Minuten“ bei 8500, 1000 und 13.000 U/min (Wert in g nicht angegeben) mit Resuspension des Pellets in verschiedenen Puffern bei jedem Schritt.

Diese zitierten Protokolle sind keineswegs die einzigen Beispiele für Ad-hoc-Zentrifugationsprotokolle, die durch eine scheinbar willkürliche Wahl der Zentrifugationsgeschwindigkeiten und/oder -zeiten gekennzeichnet sind. Eine wichtige Folge solcher Ad-hoc-Protokolle ist, dass sie keine rationale Grundlage bieten, auf der andere Protokolle zur Isolierung verschiedener Zielzellen aus anderen Matrizes/Zellmischungen entwickeln können. Es ist beispielsweise intuitiv einleuchtend, dass sich bei einer längeren Zentrifugation alle Partikel absetzen, während bei einer kurzen Zentrifugationsdauer nur die schnellsten Partikel abgesetzt werden und die meisten langsameren Partikel in der Suspension verbleiben. Die Bestimmung der optimalen Geschwindigkeit/Dauer für die Zentrifugation zur Isolierung des Zielpartikels bei gleichzeitiger Eliminierung anderer Partikel bleibt jedoch eher eine Kunst. Mit anderen Worten, die derzeit berichteten Protokolle bieten keine rationale Grundlage für Modifikationen (Bestimmung der optimalen Zentrifugationsgeschwindigkeiten/-zeiten) für andere verwandte Trennungs-/Isolierungsziele.

Materialien und Methoden

Theorie

Unsere vorgeschlagene Methode zur Trennung von zwei Partikeltypen, die ähnliche Dichten, aber aufgrund von Größenunterschieden unterschiedliche Sedimentationsgeschwindigkeiten haben, ist in Abbildung 1 dargestellt. Zu Beginn des Verfahrens (Abbildung 1(1)) wird die Suspension (in unserem Fall eine Blutkulturbrühe), die die Separanden (weiße Blutzellen oder WBCs, rote Blutzellen oder RBCs, Thrombozyten und Bakterien) enthält, als separate Schicht auf einen klaren, dichten Puffer (in unserem Fall Histopaque 1083) gegeben. Die Dichte des Puffers ist größer als die von Erythrozyten (ρ = 1,06 – 1,08 g/ml (12)) und Thrombozyten (ρ = 1,05 – 1,07 g/ml (13)), aber geringer als die von Erythrozyten (ρ = 1,1 g/ml (14)) und Bakterien (ρ = 1,105 g/ml für Escherichia coli (15)). Bei der Zentrifugation werden alle Partikel nach unten geschleudert, zunächst durch die oberste Schicht (Blutkulturmedium) und dann in den dichten Puffer (den Histopak). Während Partikel mit einer höheren Dichte als die des Puffers (Erythrozyten und Bakterien) sowohl durch die Blutkulturbrühe als auch durch den dichten Puffer sedimentieren, werden weniger dichte Separanden (Erythrozyten und Thrombozyten) von letzterem ausgeschlossen. Dieses Verfahren ähnelt dem für die Abtrennung von Erythrozyten und Thrombozyten aus Vollblut empfohlenen Protokoll (16). Für unsere Zwecke ist dieses Verfahren allein jedoch unzureichend, da zwar einige unerwünschte Partikel (Erythrozyten und Thrombozyten) aufgrund von Dichteunterschieden von den Zielpartikeln (Bakterien) getrennt werden, andere Partikel mit ähnlicher Dichte (Erythrozyten) jedoch zurückbleiben. Um unser Ziel zu erreichen, alle Zielzellen (Bakterien) zu sammeln und gleichzeitig alle verbleibenden unerwünschten Partikel (Erythrozyten) zu eliminieren, schlagen wir vor, das System in den in Abbildung 1(4) dargestellten Zustand zu versetzen und den Zentrifugationsprozess dort anzuhalten. In diesem Zustand werden alle Erythrozyten, die aufgrund ihrer größeren Größe eine höhere Absetzgeschwindigkeit haben, als Pellet am Boden des Röhrchens abgelagert, während alle Bakterienzellen in dem dichten Puffer dispergiert werden.

Um diesen gewünschten Zustand zu erreichen, müssen jedoch eine Reihe von Bedingungen erfüllt werden. Erstens müssen wir, um sicherzustellen, dass alle Bakterien im Puffer gesammelt werden, den Bakterien, die oben begonnen haben (Ebene A), genügend Zeit geben, um durch die Schicht der Blutkulturbrühe (Medium 1) und in den Histopak (Medium 2) zu wandern. Mathematisch bedeutet dies:

wobei t die Zeit ist, in der der Zentrifugationsprozess durchgeführt wird, l1 die Länge der geladenen Säule der Blutkulturbrühe und vb1 die Sedimentationsgeschwindigkeit der Bakterien in dieser Schicht. Dieser Zeitpunkt (wenn die Bakterien, die in Ebene A beginnen, gerade Ebene B durchquert haben und in den Puffer eintreten) ist in Abbildung 1(2) dargestellt.

Ein weiteres hervorstechendes Merkmal dieses Zustands ist, dass die Bakterien und die Erythrozyten zu diesem Zeitpunkt möglicherweise noch keine unterschiedlichen „Banden“ im Puffer gebildet haben. Während die Erythrozyten, die in einer bestimmten horizontalen Ebene starten, weiter wandern als die ähnlich positionierten Bakterien, haben die Erythrozyten, die in Ebene A gestartet sind, die Bakterien, die in Ebene B (Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten) gestartet sind, möglicherweise noch nicht überholt. Damit dies geschieht und die Erythrozyten und Bakterien unterschiedliche Banden im Puffer bilden, muss die Puffersäule ausreichend lang sein. Wenn die Puffersäule beispielsweise nur bis zu der durch die gestrichelte Linie in Abbildung 1(2) dargestellten Ebene reicht, können sich keine unterschiedlichen Banden bilden. Mathematisch lässt sich die Bedingung, dass die Erythrozyten (schneller absetzende Teilchen), die auf Ebene A beginnen, die Bakterien (langsamer absetzende Teilchen), die auf Ebene B beginnen, überholen, wie folgt ausdrücken:

wobei l1 und l2 die Längen der Säulen der Blutkulturbrühe (Medium 1) bzw. des Puffers (Medium 2) sind; vR1 und vR2 sind die Sedimentationsgeschwindigkeit der Erythrozyten in der Brühe bzw. im Puffer; und vb2 ist die Sedimentationsgeschwindigkeit der Bakterien im Puffer. Die obige Gleichung kann umgestellt werden und ergibt:

Zudem wäre es wünschenswert, dass alle ursprünglich in Medium 1 vorhandenen Bakterien in Medium 2 gesammelt werden. Das bedeutet, dass zu dem Zeitpunkt, zu dem die Bakterien, die oben (Ebene A) beginnen, die Grenzfläche zwischen den beiden Phasen (Ebene B) überqueren, die Bakterien, die in Ebene B beginnen, noch nicht den Boden erreicht haben dürfen. Mathematisch lässt sich diese Bedingung wie folgt ausdrücken:

wobei vb1 die Sedimentationsgeschwindigkeit der Bakterien in Medium 1 ist. Die obige Gleichung kann umgestellt werden und ergibt:

Wenn die Gleichungen (3) und (5) erfüllt sind, erreicht das System den in Abbildung 1(4) dargestellten Zustand, in dem alle Erythrozyten den Boden des Röhrchens erreicht haben und eine separate Schicht bilden, aber keine der Bakterien dies getan haben. (Sie befinden sich alle in Medium 2). Dieser Zustand tritt erst ein, wenn alle Erythrozyten (auch die, die in Ebene A beginnen) den Boden der Röhre erreicht haben. Mathematisch lässt sich dieser Zeitpunkt (t1) wie folgt darstellen:

Der Zustand hört auf zu existieren, wenn die Bakterien (die ursprünglich an der Grenzfläche, d. h. in Ebene B, vorhanden waren) beginnen, den Boden der Röhre zu erreichen. Die Zeit, zu der dies geschieht (t2), ist gegeben durch:

Um also die bestmögliche Trennung zu erreichen, muss man (i) sicherstellen, dass die Säulenlängen der beiden Medien die Gleichungen (3) und (5) erfüllen; und (ii) dass die Dauer, für die der Sedimentationsprozess durchgeführt wird (tZentrifugation), gegeben ist durch:

Wird die Zentrifugation länger als t2 fortgesetzt, führt dies zu der in Abbildung 1(5) dargestellten Situation, in der einige oder alle Bakterien ebenfalls zu Boden sedimentieren. Um reine Isolate der gewünschten Spezies zu erhalten, muss der Zentrifugationsprozess in dem Stadium, das Abbildung 1(4) entspricht, gestoppt, die obere Schicht verworfen und der dichte Puffer abgezogen werden, ohne das Sediment am Boden zu stören. Falls gewünscht, können die Zielpartikel zentrifugiert und in anderen Medien resuspendiert werden.

Dieses „Arbeitsfenster“ zwischen t1 und t2 ist in Abbildung 2 schematisch dargestellt. Hier zeigt die Abszisse die Zeit der Zentrifugation, während die Ordinate den Anteil der Erythrozyten- und Bakterienpartikel zeigt, die im dichten Puffer (Medium 2) vorhanden sind. Bei beiden steigt der Anteil zunächst an, wenn sie von der obersten Schicht einwandern, bleibt eine Zeit lang konstant, wenn sie als Band durch den dichten Puffer wandern, und nimmt schließlich ab, wenn sie sich am Boden absetzen. Schneller wandernde Erythrozyten haben einen steileren Anstieg/Abfall und eine kürzere Zeitspanne, in der alle Erythrozyten in dem dichten Puffer vorhanden sind. Während des „Betriebsfensters“ (trübes Kästchen) sind praktisch alle Bakterien (∼100 %) im Puffer vorhanden, aber praktisch keine Erythrozyten (∼ 0 %).

Die Sedimentationsgeschwindigkeiten der Erythrozyten und der Bakterien (die die numerischen Werte der durch die Gleichungen 3, 5 und 8 gegebenen Randbedingungen bestimmen) können auf der Grundlage ihrer jeweiligen Formen, Größen und Dichten vorhergesagt werden. Die Sedimentationsgeschwindigkeit (17) ergibt sich aus der Gleichung:

wobei ρ und ρl die Dichten der Partikel bzw. der Flüssigkeit, µ die Viskosität der Flüssigkeit, R der effektive Radius der Partikel und g die Beschleunigung aufgrund der Schwerkraft/Zentrifugation sind. E. coli sind stäbchenförmige Bakterien, die 2 Mikrometer lang sind und einen Durchmesser von 0,5 Mikrometer haben (18). Daher können wir sie als längliche Sphäroide modellieren, deren effektiver Sedimentationsradius (R) gegeben ist (19) durch:

wobei a und b die Halblängen der Haupt- und Nebenachse sind. Für E. coli ist also a = 1 Mikrometer und b = 0,25 Mikrometer. Auf der Grundlage dieser Werte erwarten wir, dass E. coli eine Sedimentationsgeschwindigkeit von 26,7 Mikron/Sekunde durch die obere Flüssigkeit und eine Geschwindigkeit von 6,56 Mikron/Sekunde durch die Histopaque 1083 hat.

Andererseits sind die menschlichen Erythrozyten bikonkave Scheiben mit einem Durchmesser von 7-8 Mikron und einer Dicke von 2 Mikron (20). Sie können daher als abgeflachte Sphäroide modelliert werden, deren effektiver Sedimentationsradius (19) gegeben ist durch:

wobei a und b jeweils die halbe Länge der Haupt- und Nebenachse sind. Bei Werten von 4 Mikrometern für a und 1 Mikrometer für b sagen wir voraus, dass sich die Erythrozyten bei einer Zentrifugation mit unserem Gerät, einem Eppendorf-5804, bei einer relativen Zentrifugalkraft von 400×g mit einer Geschwindigkeit von 500 Mikrometern/Sekunde durch die oberste Schicht der Dichte ∼1.02 g/ml (von uns gemessen) und 101 Mikrometer/Sekunde durch die Histopak-Schicht (Dichte = 1,083 g/ml) absetzen.

Die Absetzgeschwindigkeit von Partikeln lässt sich genauer vorhersagen, wenn man die Partikel-Partikel-Wechselwirkungen berücksichtigt. Diese Teilchen-Teilchen-Wechselwirkungen entstehen, wenn die von einem absetzenden Teilchen nach oben verdrängte Flüssigkeit auf andere Teilchen unmittelbar hinter oder neben dem ersten Teilchen auftrifft, wodurch letztere einem erhöhten Flüssigkeitswiderstand ausgesetzt werden und dadurch die effektive (durchschnittliche) Sedimentationsgeschwindigkeit der Teilchen als Gruppe verringert wird. Dieses Phänomen wird als „behindertes Absetzen“ bezeichnet und muss berücksichtigt werden, wenn der Volumenanteil der Partikel nicht vernachlässigbar ist. Zur Berechnung der effektiven Absetzgeschwindigkeit für Systeme mit behindertem Absetzen gibt es eine Reihe von halbanalytischen oder empirischen Ausdrücken (21). Ein solcher Ansatz ist die Richardson-Zaki-Korrelation, bei der die effektive Absetzgeschwindigkeit (v′) durch gegeben ist:

wobei v die Absetzgeschwindigkeit des Teilchens im nicht behinderten Fall und φ der Volumenanteil der Teilchen ist. Blut wird in der Regel mit einer 1:4-Verdünnung in Blutkulturbrühe verdünnt (22). Da der Hämatokrit (Volumenanteil der Erythrozyten im Blut) typischerweise bei 0,4-0,45 liegt (23), beträgt der resultierende Volumenanteil der Erythrozyten in unserer Probe etwa 0,1. Berücksichtigt man dies mit Hilfe von Gleichung 12, dann betragen die vorhergesagten Absetzgeschwindigkeiten für Erythrozyten in den Medien 1 und 2 307 Mikrometer/Sekunde bzw. 62 Mikrometer/Sekunde. Außerdem enthalten Blutkulturen zu dem Zeitpunkt, zu dem sie positiv werden, ∼108 KBE (koloniebildende Einheiten) (Zellen) von Bakterien pro ml Suspension (24). Aufgrund ihrer geringen Größe (Radius ∼1 Mikron) bleibt ihr Volumenanteil jedoch unter 0,001, und der Effekt des „behinderten Absetzens“ kann vernachlässigt werden.

Bei einem Probenvolumen, aus dem man die gewünschte(n) Zellart(en) isolieren möchte, kann das Flussdiagramm in den ergänzenden Materialien (ergänzende Abbildung 1) verwendet werden, um die Wahl des Sedimentationspuffers zu leiten, die Sedimentationsgeschwindigkeiten der gewünschten Zellen im besagten Puffer vorherzusagen, das geeignete Volumen (Säulenlänge im verfügbaren Zentrifugationsröhrchen) zu bestimmen und schließlich die optimale Zentrifugationsdauer (Betriebsfenster) unter Verwendung der verfügbaren Zentrifuge(n) zu berechnen. Für unser System (5 ml „positive“ Blutkulturbrühe in 15-ml-Zentrifugenröhrchen) ist das Verfahren in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1. Theoretische Vorhersagen von minimalen Säulenlängen und minimalen/maximalen Betriebszeiten.

Experimentelle Validierung

Wir stellten zunächst eine synthetische „positive Blutkulturbrühe“ her, indem wir in 8ml BACTEC Ped-Plus Medium (Becton Dickinson, Sparks, MD) 2ml frisches Blut (von einem Probanden entnommen) und 0.1 ml einer Suspension mit ∼104 KBE (Zellen) pro ml E. coli K-12 und Inkubation der Mischung auf einem Rührwerk bei 37 °C über Nacht (12-14 h), um eine Suspension mit ∼109 Erythrozyten/ml und 108 KBE/ml Bakterien zu erhalten. 1,5 mL der Brühe wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf, New York, USA) gegeben und die Zellen durch Zentrifugation „pelletiert“. Der Überstand wurde entnommen und die Masse von 1 ml mit einer Waage (OHaus® GA-110) gemessen, um die Dichte der Flüssigkeit in der Brühe abzuschätzen.

Zusätzlich wurden 5 ml der positiven Blutkulturbrühe auf 5 ml Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) gegeben. Mehrere solcher Röhrchen wurden in eine Eppendorf-5804 Tischzentrifuge gestellt und unterschiedlich lange zentrifugiert (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min und 90 min). Am Ende des Zentrifugationsvorgangs wurde das Röhrchen vorsichtig entfernt, die oberste Schicht (Blutkulturbrühe) verworfen und die histopake Schicht aufgefangen, ohne das Sediment am Boden (falls vorhanden) zu stören. Die Bakterienkonzentration in der gesammelten Flüssigkeit wurde mit Standardmethoden bestimmt, die serielle Verdünnung, Ausplattieren auf Tryptic Soy Agar, Bebrütung und Koloniezählung umfassen (25). Die Konzentrationen der Erythrozyten wurden durch Untersuchung eines Aliquots der Probe in einem Hämozytometer unter einem Mikroskop ermittelt (26).

Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 zusammengefasst. Die Linien stellen die theoretische Anzahl von Blutzellen oder Bakterien dar, die aufgrund unserer theoretischen Vorhersagen in der Histopakschicht (abzüglich des Sediments am Boden) zu erwarten sind. Die durchgezogenen Symbole stellen den Durchschnitt von mindestens drei Messwerten der beobachteten Anzahl von Erythrozyten (Quadrate) und E. coli (Rauten) dar. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an.

Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, stimmt das beobachtete Verhalten qualitativ mit unseren Vorhersagen überein; für beide dichten Partikel (Erythrozyten und Bakterien) steigen die Konzentrationen in der Histopak-Schicht zunächst mit der Zeit an, bleiben dann über eine bestimmte Dauer konstant und nehmen schließlich ab. Es wurde jedoch festgestellt, dass bei den Erythrozyten der gesamte Prozess (Anstieg, stabiler Zustand und Rückgang) etwas langsamer abläuft als vorhergesagt. Die Auswirkung dieser geringfügig niedrigeren Sedimentationsrate wirkt sich glücklicherweise nicht auf unser Betriebsfenster aus, da der Beginn des Fensters durch die Zeit bestimmt wird, die alle Bakterien benötigen, um in den dichten Puffer zu gelangen. Zu diesem Zeitpunkt ist die Konzentration der Erythrozyten im dichten Puffer vernachlässigbar. Mit anderen Worten, das von unseren Modellen vorhergesagte Betriebsfenster (∼20 min bis ∼75 min) hat sich bewahrheitet.

Die meisten häufig vorkommenden Bakterien sind ebenfalls ziemlich klein (∼1 Mikron charakteristische Länge) und ihre Dichten sind ähnlich. (z. B. 1,1 g/ml für Pseudomonas (27); 1,13 g/ml für Streptococcus (28) und 1,135 g/ml für Bacillus (29)). Es ist daher wahrscheinlich, dass sie sowohl in Blutkulturbrühe als auch in Histopaque-1083 vergleichbare Sedimentationsgeschwindigkeiten wie E. coli haben, und folglich sollte auch das Arbeitsfenster ähnlich sein. Obwohl unser Betriebsfenster (∼20 min bis ∼75 min) nur für unsere Hardware und experimentellen Parameter gilt, bietet unsere theoretische Analyse eine Grundlage für die Vorhersage anderer Betriebsfenster, nicht nur für die Isolierung von Bakterien aus positiven Blutkulturbrühen unter Verwendung anderer Hardware, sondern auch für die Isolierung anderer Zielzellen aus verschiedenen Matrices unter Verwendung dichter Puffer. Diese Methode kann auch sequentiell eingesetzt werden, um ein Ziel aus einem Gemisch zu isolieren, das sowohl schneller absetzende als auch langsamer absetzende Arten enthält. In solchen Fällen würde man unsere Methode verwenden, um zunächst alle sich schneller bewegenden Arten zu eliminieren und anschließend die sich am schnellsten absetzenden Arten in der verbleibenden Mischung zu sammeln.