Klinische und genetische Heterogenität des 15q13.3-Mikrodeletionssyndroms

Abstract

Die 15q13.3-Mikrodeletion ist eine wiederkehrende CNV, die vermutlich durch NAHR zwischen segmentalen Duplikationen im Chromosom 15 vermittelt wird. Die 15q13.3-Deletion und -Duplikation werden mit einer Vielzahl von klinischen Manifestationen in Verbindung gebracht, wie z. B. intellektuellen Defiziten, Krampfanfällen, Autismus, Sprach- und Entwicklungsverzögerungen, neuropsychiatrischen Beeinträchtigungen und Verhaltensproblemen, die eine unvollständige Penetranz und Expressivität aufweisen. Diese Studie umfasst eine Auswertung von 106 symptomatischen Patienten, die die heterozygote Deletion tragen, sowie von 21 Patienten, die die Duplikation tragen, die in früheren Studien beschrieben wurden. Die Analyse zeigt eine erhebliche Heterogenität bei der Manifestation verschiedener Schlüsselsymptome und dem familiären Auftreten. Darüber hinaus werden 8 neue Patienten vorgestellt. Konvolutierte familiäre Zusammenhänge geben neue Einblicke in die Komplexität der Symptomausprägung. In früheren Studien wurden unterschiedliche Meinungen über die Art und genaue Lage der Deletionsbruchpunkte geäußert. Hier zeigen wir, dass nicht CHRNA7 und CHRFAM7A, sondern FAM7A oder GOLGA8 als Bruchpunktregionen bei unseren Patienten dienen. Die Deletion wird als heterogen in ihrer Größe beschrieben. Wir gehen jedoch davon aus, dass nicht nur unterschiedliche Bruchpunkte, sondern auch die Ungenauigkeit der aCGH-Analyse auf Chromosom 15 aufgrund segmentaler Duplikationen für die Variabilität in der Größe verantwortlich ist.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Das 15q13.3-Mikrodeletionssyndrom (OMIM 612002), das erstmals von Sharp et al. beschrieben wurde, ist eine wiederkehrende CNV, die vermutlich durch NAHR zwischen segmentalen Duplikationen (BP3-BP5, BP4-BP5) auf Chromosom 15 vermittelt wird. Die 15q13.3-Deletion und -Duplikation werden mit einer Vielzahl von neurologischen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht, wie z. B. intellektuellen Defiziten, Krampfanfällen, Autismus, Sprach- und Entwicklungsverzögerungen, neuropsychiatrischen Beeinträchtigungen und Verhaltensproblemen mit unvollständiger Penetranz und variabler Expressivität. Die typische 1,6-Mb-Deletion beherbergt 7 Gene: ARHGAP11B, MTMR10, MTMR 15, TRPM1, KLF13, OTUD7A und CHRNA7. CHRNA7 kodiert für den neuronalen nikotinischen Acetylcholinrezeptor alpha7 und wird daher als das Hauptkandidatengen angesehen, das für die geäußerten klinischen Merkmale verantwortlich ist.

In dieser Studie beschreiben wir 6 bisher unveröffentlichte Patienten, die die typische 15q13.3-Mikrodeletion zwischen BP4 und BP5 tragen, darunter eine Familie mit 4 betroffenen Mitgliedern, die weiter unten beschrieben werden. Darüber hinaus werden 1 Patient mit einer 15q13.3-Duplikation und 1 Patient mit einer 3,4-Mb-Deletion zwischen BP3 und BP5 beschrieben.

Um die Vielfalt der klinischen Manifestationen und die Schwere der Symptome zu erklären, haben wir außerdem die Daten von 106 symptomatischen Patienten mit heterozygoter 15q13.3-Deletion und 21 Patienten mit Duplikationen, über die bereits berichtet wurde.

In neueren Studien sind unterschiedliche Meinungen über die Art und die genaue Lage der Deletionsbruchpunkte aufgekommen. Wir untersuchten die Lage der Bruchpunkte mit FISH, um zu bestätigen, inwieweit diese Optionen für unsere Patienten zutreffen.

Methoden

DNA-Extraktion und Array-CGH

Periphere Blutleukozyten wurden als DNA-Quelle verwendet. Die Array-CGH-Analyse wurde mit einem Array Slide Sure Print 4x180K (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA) durchgeführt. Die Patienten-DNA wurde mit Cy3 markiert, die Referenz-DNA mit Cy5. Die Hybridisierung wurde mit Cot-1-DNA (1,0 µg/ml) durchgeführt. Die Test-DNA-Proben wurden mit geschlechtsspezifischer Referenz-DNA (Agilent) hybridisiert. Reinigung, Hybridisierung und Waschschritte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Verwendet wurden der Sure Scan Microarray Scanner G2600D (Agilent), die Feature Extraction Software (Agilent) und die Agilent Cytogenomics Software Edition 2.0.6.0.

FISH und Breakpoint Analysis

Die Objektträger mit Metaphasen von kultivierten peripheren Lymphozyten wurden bei -70°C gelagert. Vor der Hybridisierung wurden die Objektträger in einer Alkoholreihe (70, 80 und 100 %) behandelt, gefolgt von einer Pepsinbehandlung (15 min, 37°C). Als FISH-Sonden wurden Fluoreszenz-markierte BACs (Illumina®, BlueFish) verwendet. Die Vorbereitung der Sonden, die Hybridisierung und die Waschschritte wurden gemäß den Anweisungen von Illumina durchgeführt.

Die verwendeten BAC-Sonden waren RP11-11H9, 22.067.176-22.300.706, chr.15q11.2; RP11-40J8, 30.546.758-30.724.265, chr.15q13.2; RP11-348B17, 31.281.641-31.502.115, chr.15q.13.3; RP11-265I17, 32.293.149-32.457.541, chr.15q13.3; RP11-280K19, 32.654.212-32.821.799, chr.15q13.3, und RP11-232J12, 53.792.861-53.948.902, chr.15q21.3 (siehe Abb. 1, hg19).

Ergebnisse

Klinische Beurteilung

Die Patienten wurden zunächst anlässlich einer neuropädiatrischen Untersuchung wegen intellektueller Defizite und/oder Entwicklungsverzögerungen beobachtet. Tabelle 1 fasst die zytogenetischen und klinischen Befunde zusammen.

Beschreibung der Patienten

Patient 1 (III/1)

Das 13-jährige Mädchen stellte sich mit Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS), intellektuellen Defiziten, Entwicklungsverzögerung, rezidivierenden Atemwegsinfektionen und Skoliose vor. Ihr Gewicht und ihr Kopfumfang (OFC) schwanken um die 10. Perzentile (P) bzw. P90. Sie besucht eine Sonderschule. Ihre Mutter (II/2, in Abb. 2) besuchte ebenfalls eine Sonderschule und schloss diese erfolgreich ab. Beide Eltern waren für weitere Untersuchungen nicht erreichbar. Patientin 1 ist eine Halbschwester der Patienten 2 und 3 und die Cousine von Patientin 4.

Patient 2 (III/2)

Die Patientin wurde im Alter von 9 Jahren vorgestellt und zeigte Entwicklungs- und Sprachverzögerungen sowie intellektuelle Defizite (K-ABC-Test: IQ 63). Ein Aufwach-EEG zeigte allgemeine Veränderungen, jedoch traten bisher keine Krampfanfälle auf. Ihr OFC liegt zwischen P3 und P10, Gewicht und Größe liegen im Normalbereich. ADHS wird mit Methylphenidat behandelt. Sie wird als fröhliche, aber auch aggressive und impulsive Person beschrieben und besucht eine Sonderschule. Beide Eltern waren für weitere Untersuchungen nicht erreichbar.

Patientin 3 (III/3)

Bei der 10-jährigen Patientin wurde eine Lernstörung diagnostiziert, die nicht näher definiert wurde. Die Körpermaße des Mädchens weisen eine hohe zeitliche Schwankung auf. Bis zum Alter von 2 Jahren lag ihr OFC bei P<3; derzeit liegt ihr Gewicht bei P97. Sie ist fettleibig, zeigt stereotypes Verhalten und besucht eine Sonderschule.

Patientin 4 (III/6)

Die Untersuchung der Patientin (13 Jahre alt) ergab Sprach- und psychomotorische Verzögerungen sowie leichte intellektuelle Defizite (HAWIK-IV: SW 56). Auffällig sind multiple Dyslalie und ADHS, das mit Methylphenidat (10-15 mg/Tag) behandelt wird. Das EEG des Jungen ist unauffällig, sein OFC ist normal, seine Größe P90 und sein Gewicht P97. Der Charakter des Patienten wird als freundlich, aber bisweilen auch aggressiv und impulsiv beschrieben. Er besucht eine Schule für Behinderte. Beide Eltern besuchten eine Sonderschule. Sein Vater (II/5) ist wegen Körperverletzung inhaftiert. Seine beiden Schwestern (III/7, III/8) besuchen ebenfalls eine Sonderschule, und sein Halbbruder (III/9) zeigt eine Entwicklungs- und Sprachverzögerung, ist aber nicht Träger der Deletion. Der Patient ist der Cousin der Patienten 1, 2 und 3. Die Eltern waren für die Untersuchung nicht erreichbar.

Patient 5

Der Patient (14 Jahre alt) stellte sich mit abnormem Sozialverhalten und ADHS vor. Aufgrund seiner schlechten schulischen Leistungen und der Diskrepanz zwischen seinen intellektuellen Leistungen (HAMIK-IV, IQ 78) und dem Mittelwert der Familie wurde eine medizinische Untersuchung eingeleitet. Nach einem epileptischen Anfall wurde er erfolgreich mit Orfiril® behandelt. ADHS wird mit Methylphenidat (5-10 mg/Tag) behandelt. Seine Eltern waren für eine Untersuchung nicht erreichbar.

Patient 6

Als Säugling zeigte Patient 6 eine Entwicklungs- und Sprachverzögerung. Er zeigte Anzeichen von Hypotonie. Zum Zeitpunkt der Untersuchung wies der 19-jährige Patient intellektuelle Defizite und ADHS auf. Die Behandlung mit Methylphenidat wurde abgesetzt, nachdem der Patient mit Hochleistungssport begonnen hatte, was sich als wirksame Behandlung der ADHS-Symptome erwies. Seine Mutter ist keine Deletionsträgerin. Sein Vater stand für Untersuchungen nicht zur Verfügung.

Patient 7

Der Patient wurde im Alter von 7 Jahren untersucht und zeigte leichte intellektuelle Defizite (K-ABC-Test, SW: 63). Seine Körpermaße liegen alle innerhalb von P10. Er wird als unruhig und unaufmerksam beschrieben. Er besucht eine Sonderschule. Seine Eltern waren für eine Untersuchung nicht erreichbar.

Patient 8

Der Patient wurde mit einem Herzfehler (Ventrikelseptumdefekt und Vorhofseptumdefekt) geboren. Er zeigt dysmorphe Merkmale wie tief angesetzte Ohren, Hypertelorismus, Strabismus und Hypotonie. Seine psychomotorische Entwicklung ist verzögert. Die Geburtslänge und die OFC des Patienten waren P50, sein Gewicht war P10. Er hat die Duplikation von seinem Vater geerbt, der einen unauffälligen Phänotyp aufweist. Es wurde über einen Onkel (mütterlicherseits) mit Epilepsie und maligner Hyperthermie berichtet.

Breakpoint Analysis

In früheren Studien war die Heterogenität der Deletionsgröße ein Thema von Interesse. Shinawi et al. nahmen an, dass FAM7A1/2 als Bruchpunkt fungiert, während Szafranski et al. CHRNA7 und CHRFAM7A für die wiederkehrende Deletion im 15q13.3-Lokus verantwortlich machten. Antonacci et al. schlugen die Genfamilie GOLGA8 als mögliche Kandidaten vor. Es wurde versucht, diese Theorien mit Hilfe von FISH zu validieren. Sonde 4 markiert CHRNA7, Sonde 5 markiert FAM7A, Sonde 2 markiert CHRFAM7A und Sonde 3 markiert eine Region distal von CHRFAM7A (Abb. 1). Bei unseren Patienten ist FAM7A in beiden Chromosomen 15 nachweisbar. Dieser Befund deutet darauf hin, dass sich der distale Bruchpunkt zwischen CHRNA7 und FAM7A befindet. Die Analyse der Patienten 7 und 4 zeigt, dass der proximale Bruchpunkt distal zu CHRFAM7A liegt (Abb. 3, 4). Bei Patient 7 überbrückt die Sonde 3 den Bruchpunkt. Daher vermitteln CHRNA7 und CHRFAM7A nicht die rekurrente Deletion bei unseren Patienten.

Auswertung von symptomatischen Patienten, die in früheren Studien beschrieben wurden

Für Patienten und Studien siehe Tabelle 2 und Online-Zusatzmaterial 1 (für das gesamte Online-Zusatzmaterial siehe www.karger.com/doi/10.1159/000443343). Die statistische Analyse wurde mit dem exakten Test von Fisher und der Software „R“ durchgeführt. Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als signifikant bewertet.

Diskussion

Die von uns vorgestellte Familie zeigt interessante Merkmale. Zum einen variiert der Verwandtschaftsgrad, zum anderen unterscheiden sich auch die Symptome (Abb. 2). Ein Zusammenhang zwischen dem Verwandtschaftsgrad und den Symptomen ist jedoch nicht nachweisbar. Die Patientinnen 2 und 3, die Schwestern sind, sind bemerkenswert unterschiedlich. Sie unterscheiden sich erheblich in den Körpermaßen, im Charakter und in der Schwere der Symptome, obwohl sie ähnlichen Umweltfaktoren ausgesetzt sind und die gleiche Deletionsgröße tragen. Daher müssen andere genetische Faktoren das Ausmaß der klinischen Manifestationen beeinflussen. Eine mögliche Erklärung könnte eine veränderte Expression ihrer Gene im Genom sein, die unterschiedliche Auswirkungen haben kann. Dieser Ansatz wurde von Henrichsen et al. weiter bestätigt, die gezeigt haben, dass CNV-Regionen auf niedrigerem und variablerem Niveau exprimiert werden und die Expression benachbarter Gene verändern. Chaignat et al. stellten fest, dass CNVs den Zeitpunkt der Expression von Genen während der Entwicklung von Mäusen verändern. Darüber hinaus können bei verschiedenen Individuen unterschiedliche zeitliche Muster der Expression gefunden werden. Darüber hinaus könnten eine veränderte Expression oder Mutationen verschiedener Gene, die für verschiedene Schritte desselben neurobiologischen Weges kodieren, neurologische Symptome verstärken. Poot et al. schlagen verschiedene Mechanismen vor, die zu einer phänotypischen Pleiotropie von CNVs führen können, z. B. die Interaktion von CNVs, genetische Epistase oder allelischer Ausschluss.

Drei von vier Familienmitgliedern weisen ADHS auf; alle zeigen Entwicklungsverzögerungen. Da die Entstehung von ADHS offenbar multifaktoriell bedingt ist, ist es nicht überraschend, eine Häufung in einer Familie zu finden. Bemerkenswert ist, dass alle Kinder von der Deletion betroffen sind. Besondere familiäre genetische Konstellationen erhöhen möglicherweise die Wahrscheinlichkeit, Symptome zu manifestieren. Außerdem könnte die intrauterine Umgebung der Deletion tragenden Mutter den Phänotyp ihrer Kinder beeinflusst haben. Es konnten jedoch keine gemeinsamen CNVs identifiziert werden, die mit dem Auftreten von Symptomen korrelieren, und bei keinem unserer Patienten konnte eine zweite pathogene CNV identifiziert werden.

Die Bruchpunktanalyse zeigt, dass der distale Bruchpunkt distal zu CHRNA7 positioniert ist. Mögliche Positionen wären innerhalb der Genfamilien FAM7A oder GOLGA8, wie bereits vorgeschlagen wurde, oder innerhalb der Lokuskontrollregionen . Der proximale Bruchpunkt befindet sich distal von CHRFAM7A. Bei den Patienten 1-4, die zu einer Familie gehören, unterscheiden sich die von der aCGH-Analysesoftware ermittelten Deletionsgrößen. Diese Unterschiede werden durch Lücken im Verteilungsmuster der Oligonukleotide im aCGH innerhalb und um die Bruchpunktregionen verursacht. Geringfügige Änderungen des logarithmischen Verhältnisses der am Rande gelegenen Oligonukleotide führen zu einer erheblichen Verschiebung der von der Analysesoftware ermittelten Deletionsgröße. Der offensichtliche Größenunterschied bei der rekurrenten Deletion 15q13.3 ist höchstwahrscheinlich ein Artefakt der Verarbeitungssoftware. Wir gehen davon aus, dass die Deletion bei allen Familienmitgliedern gleich groß ist (siehe online suppl. Material 2).

Verschiedene CNV-Studien haben eine Assoziation der 15q13.3-Mikrodeletion mit Schizophrenie, Epilepsie und Autismus. Es wurden mehrere Veröffentlichungen herausgegeben, in denen neue Fälle und Theorien über Bruchpunkte und Faktoren, die die Symptome verändern, vorgestellt wurden. Es wurden Anstrengungen unternommen, diese Informationen zusammenzuführen, um neue Zusammenhänge zu finden.

Die Ergebnisse lassen Raum für Spekulationen. Deletionen werden in 80,88% vererbt. Mütterlicherseits werden Deletionen (54,41%, p = 0,001) und Duplikationen (53,33%, p = 0,027) überproportional häufig beschrieben.

Eine Erklärung könnten Sinkus et al. liefern: Sie untersuchten den Einfluss von CHRNA7-Promotor-Polymorphismen, die das Transkriptionsniveau um ∼25% senken und den Cortisolspiegel bei Mutter und Kind beeinflussen. Der Cortisolspiegel des Kindes wird weiter gesenkt, wenn sowohl die Mutter als auch das Kind Polymorphismusträger sind. Die Auswirkungen der intrauterinen Umgebung können sich auch auf andere Faktoren auswirken. Die OFC ist bei Patienten reduziert, wenn die Deletion von der Mutter vererbt wird (P<25 bei 50%, p = 0,002). Wir gehen daher davon aus, dass die intrauterine Umgebung die Symptome verstärkt, wenn die Aberration von der Mutter vererbt wird. Da wir nur symptomatische Patienten in diese Untersuchung einbezogen haben, würde dies erklären, warum die Mehrheit der Aberrationen offenbar mütterlichen Ursprungs ist (54 %, p = 0,001). In diesem Zusammenhang ist auffällig, dass die Deletion geschlechtsspezifisch gleich verteilt ist. Unsere Daten bestätigen die Ergebnisse von Lowther et al. In ihrer umfassenden Übersicht über die 15q13.3-Deletion haben sie symptomatische und asymptomatische Patienten zusammengefasst. Da wir nur symptomatische Patienten einbezogen haben, sind die Anteile der Verteilungsmuster der Merkmale ähnlich, aber die relativen Zahlen unterscheiden sich. Hinsichtlich des erhöhten mütterlichen Anteils von Deletionen nennen sie eine reduzierte reproduktive Fitness bei Männern als mögliche Erklärung.

Die Größe der Deletion korreliert nicht durchgängig mit dem Grad der Symptome. Vergleicht man zum Beispiel den Grad der intellektuellen Defizite mit der Größe der Deletion, so zeigt sich kein linearer Zusammenhang. Patienten mit der typischen 1,6-Mb-Deletion zeigen häufiger schwere Defizite als Patienten mit kleineren oder größeren Deletionen (41,07 %, p = 0,00045). Intellektuelle Defizite werden signifikant häufiger bei Patienten mit Deletionen als mit Duplikationen angegeben (79,78 und 55,56%, p = 0,037). Wie erwartet wird normale Intelligenz am häufigsten bei Patienten mit Deletionen <1 Mb beschrieben (45%, p = 0,0037).

Deletionen mit einer Größe von 1-1,6 Mb sind am häufigsten (63,21%, p = 0,0002). Duplikationen <1 Mb (66,67%, p = 0,0004) sind am häufigsten beschrieben. Bei den Deletionen werden intellektuelle Defizite (79,78 %), Sprachstörungen (75,34 %), ein auffälliger Phänotyp der Eltern (66,67 %) und Verhaltensprobleme (63,64 %) viel häufiger beschrieben als Epilepsie (30,61 %) oder Autismus (27,71 %) (p = 0,02-3,931E-09). Vergleicht man Duplikationen und Deletionen, so sind Duplikationen häufiger mit Autismus assoziiert (p = 0,039) und der Phänotyp der Eltern ist deutlich seltener (p = 0,027).

Epilepsie ist signifikant mit leichten intellektuellen Defiziten assoziiert (59,09%, p = 0,0029). Sprachstörungen sind in 79,24 % der Fälle mit intellektuellen Defiziten verbunden (p = 0,003).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der klinische Phänotyp der Mikrodeletion 15q13.3 multifaktoriell bedingt ist. Selbst enge Familienmitglieder, die ähnlichen Umweltfaktoren ausgesetzt sind, unterscheiden sich in ihren klinischen Manifestationen erheblich. Die genetische Beratung in Familien mit 15q13.3-Mikrodeletionen oder insbesondere Mikroduplikationen bleibt daher komplex und gelegentlich unzureichend. Weitere Untersuchungen der genetischen Veränderungen im Bereich der nichtdeletierten Allele oder der Promotorregionen der betroffenen Gene könnten vielversprechender sein, wenn es darum geht, Einflussfaktoren zu entdecken.

Danksagung

Die Autoren danken Margot Fliegauf, Monika Heinkelein, Helga Heitzler und Claudia Ladwig in der zytogenetischen Gruppe des Instituts für Humangenetik in Freiburg für ihre experimentelle Beratung und Unterstützung. Wir danken auch Ekkehart Lausch, Elke Botzenhart, Susanne Munk-Schulenburg und Andreas Busche für die Betreuung der Patienten. Wir danken den Patienten und ihren Familien für ihre freundliche Kooperation.

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Die Autoren haben keine ethischen Konflikte offenzulegen.

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