Klonogener Assay: was, warum und wie

Ein klonogener Assay, auch bekannt als Koloniebildungstest

ist ein In-vitro-Zellüberlebenstest. Er bewertet die Fähigkeit einzelner Zellen, zu überleben und sich zu vermehren, um Kolonien zu bilden.1 Dieser Test wurde erstmals in den 1950er Jahren beschrieben, wo er zur Untersuchung der Auswirkungen von Strahlung auf das Überleben und Wachstum von Krebszellen verwendet wurde, und hat in der Folge eine wesentliche Rolle in der Strahlenbiologie gespielt.2

Um die Klonogenität zu messen, müssen die Zellen in sehr geringer Dichte ausgesät und für einen Zeitraum von 1-3 Wochen belassen werden, damit sich Kolonien bilden. Die Kolonien werden dann fixiert, mit Kristallviolett angefärbt, um sie sichtbar zu machen, und gezählt. Zur Analyse der Daten werden Zellüberlebenskurven aufgezeichnet. Heute werden klonogene Assays zur Beantwortung einer Vielzahl experimenteller Fragen verwendet, insbesondere in der Krebsbiologie.

Dieser Blog beleuchtet:

Wie man einen klonogenen Assay durchführt und welche wichtigen Überlegungen dabei anzustellen sind

Nutzung markierungsfreier Mikroskopie und Konfluenzdetektion zur Beurteilung der Koloniezahl und -größe mit automatischer Bildquantifizierung

Der klonogene Überlebensassay

Klonogene Assays werden in der Krebsforschung häufig verwendet, da die Bildung von Klonen als Merkmal von Krebszellen mit tumorauslösenden Fähigkeiten interpretiert wird. Ursprünglich wurde dieser Test im Bereich der Radiobiologie eingesetzt, ist aber inzwischen ein Standardinstrument in der Krebsforschung zur Bewertung des Zellwachstums und der zytotoxischen oder genotoxischen Wirkungen verschiedener Wirkstoffe mit potenzieller klinischer Anwendung. Dazu gehören Chemotherapeutika und zielgerichtete Therapien allein oder in Kombination 3.

Clonogenes Wachstum wird auch zur Bewertung der Stammzelleneigenschaft bestimmter Zellpopulationen verwendet, da Stammzellen langlebige Zellen mit dem Potenzial zur ständigen Vermehrung sind. Dies ist besonders für die Krebsforschung von Bedeutung, da Krebsstammzellen häufig mit Chemoresistenz, der Bildung von Sekundärtumoren und dem Wiederauftreten von Krebs in Verbindung gebracht werden. Daher ist die Untersuchung der Krebsstammzellen mit Hilfe eines klonogenen Assays ein wertvolles und weit verbreitetes Instrument zur Vorhersage der Wirksamkeit einer bestimmten Therapie.4

Klonogene Assays messen die Fähigkeit von Zellen, ihre reproduktive Integrität über einen längeren Zeitraum zu bewahren. Dies ist ein wichtiges Merkmal, da es phänotypische Effekte aufzeigt, die Zeit und möglicherweise mehrere Zellteilungen benötigen, um sich zu entwickeln. Bei der Analyse von Therapieresistenzen ist dies besonders wichtig. Mit kurzfristigen Zytotoxizitätstests lässt sich eine Arzneimittelresistenz nicht feststellen.5

Wie man einen klonogenen Assay durchführt

Die Informationen in diesem Abschnitt stammen von Franken et al. (2006), die ein Protokoll für einen klonogenen Assay in Nature Protocols1 veröffentlicht haben, kombiniert mit einigen Erkenntnissen aus meiner eigenen Erfahrung, die ich bei der Durchführung von über 60 klonogenen Assays während meiner Promotion gewonnen habe.

Es gibt im Wesentlichen zwei verschiedene Möglichkeiten, einen klonogenen Assay durchzuführen:

(1) Die Zellen können in geringer Dichte ausgesät und dann behandelt werden, um die Wirkung der Behandlung auf die Klonogenität der Zellen zu untersuchen.

(2) Die Zellen können für einen bestimmten Zeitraum behandelt und dann in geringen Dichten in behandlungsfreien Medien erneut plattiert werden, um die klonogene Fähigkeit zu prüfen.

Das letztere Verfahren wird häufig zur Bewertung der Therapieresistenz nach der Behandlung verwendet. Abbildung 1 fasst den ersten Ansatz zusammen, der die traditionelle Methode zur Durchführung eines Klonogenitätstests darstellt. Wie sich zeigen wird, ist dies eine zeitaufwändige Methode, die keine Informationen über den Verlauf des Experiments liefert (nur Endpunkt). Wir werden später automatisierte und nicht endpunktbezogene alternative Methoden diskutieren.

Traditionelles Protokoll für klonogene Assays

Abbildung. 1 | Zusammenfassung eines herkömmlichen klonogenen Protokolls, bei dem Zellen ausgesät, behandelt und dann die Klonogenität bewertet wird.

Klonogene Assays werden in der Regel in 6-Well- oder 24-Well-Platten durchgeführt. Die Zellen müssen spärlich und gleichmäßig plattiert werden, damit sich isolierte Kolonien bilden können. Daher ist es wichtig, die Aussaatdichte für die gewählte Well-Größe zu optimieren, bevor Sie Ihren klonogenen Assay durchführen.

Ein guter Ausgangspunkt ist es, in der Literatur nachzuschauen, ob es Studien gibt, die klonogene Assays mit Ihrer Zelllinie durchgeführt haben, und dann diese Aussaatdichte und zwei oder drei andere zu testen. Während dieses Optimierungsprozesses ist es auch wichtig, den Endpunkt des Versuchs (z. B. 7 Tage, 14 Tage oder 21 Tage) und die Zellwachstumsrate zu berücksichtigen, da Sie nicht wollen, dass die Kolonien miteinander verschmelzen, was die Quantifizierung und Analyse der Kolonien beeinträchtigen würde. Die Aussaatdichten sollten für alle Behandlungsbedingungen innerhalb Ihres Experiments gleich sein.
Die Verwendung der richtigen Kontrollen ist für die Analysephase entscheidend. Es sollte immer eine unbehandelte Kontrolle sowie eine reine Vehikelkontrolle verwendet werden (z. B. DMSO, PBS oder ein anderes Lösungsmittel, in dem die Behandlung aufgelöst ist). Für die Behandlungsbedingungen wird häufig eine Verdünnungsreihe verwendet. Der Behandlungszeitraum und die Intensität der Behandlung bestimmen den Konzentrationsbereich, der wahrscheinlich einer gewissen Optimierung bedarf. Jede Kontrolle und jede Versuchsbedingung sollte in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden.

Während der Koloniebildungsphase müssen Sie das Koloniewachstum unter allen Behandlungsbedingungen überwachen. Als Kolonie gelten 50 Zellen oder mehr, die nur unter dem Mikroskop sichtbar sind. Da sich dieser Test in der Regel über einen langen Zeitraum erstreckt, müssen Sie das Zellmedium wechseln. Die Zellen haben zu Beginn eine sehr niedrige Konfluenz, so dass Sie das Medium nicht so regelmäßig wechseln müssen wie sonst. Wenn Sie jedoch Zellen aussäen und dann mit einem Medikament oder einer Verbindung behandeln, ist es wichtig, die Halbwertszeit zu berücksichtigen und die Behandlung bei Bedarf zu erneuern.

Für Forscher, die daran interessiert sind, das Wachstum der Kolonien im Laufe der Zeit zu verfolgen. Wir empfehlen, sich den CytoSMART Omni anzusehen.

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Es sind oft die Kolonien unter den Kontrollbedingungen, die am schnellsten wachsen, und daher können Sie diese Zellen als Hinweis auf den Endpunkt Ihres Experiments verwenden, d.h. beenden Sie das Experiment, bevor Ihre Kolonien zu verschmelzen beginnen, und wenn dies zu schnell geschieht, verwenden Sie lieber eine niedrigere Aussaatdichte für Ihr Experiment. Es ist wichtig, das Experiment für alle Behandlungsbedingungen zur gleichen Zeit zu beenden.

Wenn Sie den Endpunkt Ihres Experiments erreicht haben, müssen die Zellen vorsichtig mit PBS gewaschen (geben Sie das PBS an den Rand der Vertiefung, um die Kolonien nicht zu stören), fixiert und mit dem DNA-Interkalationsfarbstoff Kristallviolett (0,5 % w/v) für mindestens 30 Minuten gefärbt werden. Das Entfernen der überschüssigen Färbung kann unschön sein. Am besten tauchen Sie die Platten vorsichtig in ein mit Wasser gefülltes Becherglas, bis die überschüssige Färbung entfernt ist und nur noch hellviolette Kolonien übrig sind. Gefärbte Kolonien können bis zu 50 Wochen nach der Färbung gezählt werden. Nehmen Sie hochauflösende Bilder Ihrer Wells auf, um sie für Analysen, Präsentationen und Veröffentlichungen zu verwenden.

Um Forscher bei der Analyse und Optimierung ihrer Koloniebildungstests zu unterstützen, hat CytoSMART eine Anwendung für den CytoSMART Omni eingeführt, mit der Kolonien in (Zeitraffer-)Bildern ganzer Well-Platten bei 10-facher Vergrößerung erkannt werden können. Im Inkubator kann die Zeitraffer-Bildgebung eher kinetische Informationen liefern als Endpunktbilder, die detailliertere Informationen darüber liefern, wann die Behandlung beginnt, die Zellen zu beeinflussen. Die markierungsfreie Bildanalyse wird verwendet, um Kolonien zu erkennen und ihre Größe und Kreisform zu bewerten. So lässt sich genau feststellen, wann die Kolonien zu verschmelzen beginnen, und entsprechend optimieren.

So analysieren Sie Ihren klonogenen Assay

Es ist wirklich so einfach wie das manuelle Zählen Ihrer Kolonien für jede Behandlungsbedingung und die Darstellung der Daten als Überlebenskurve (Sie sollten mindestens drei biologische Wiederholungen für Ihre Kurve verwenden).

Für eine Überlebenskurve muss der Anteil der überlebenden Zellen (SF) der behandelten Zellen (d. h. das Verhältnis der gebildeten Kolonien zu den ausgesäten Zellen) berechnet und gegen die Behandlungsdosis aufgetragen werden. Bevor Sie die SF berechnen können, muss die Ausplattierungseffizienz (PE) Ihrer Zellen bestimmt werden, da verschiedene Zelllinien unterschiedliche Ausplattierungseffizienzen haben und dies die Berechnung des Überlebensanteils beeinflusst.

PE ist das Verhältnis zwischen der Anzahl der Kolonien und der Anzahl der in Ihren unbehandelten Zellen ausgesäten Zellen1. Abbildung 1 zeigt die PE- und SF-Formeln und ein Beispiel für eine Überlebenskurve.

Das manuelle Zählen der Kolonien ist mühsam und kann zu Verzerrungen führen, weshalb eine Reihe frei verfügbarer computergestützter Bildanalysewerkzeuge entwickelt wurden, um Bilder von klonogenen Assays schnell und objektiv zu analysieren. Erwähnenswert ist das von Brzozowska et al. (2019) entwickelte, frei verfügbare Softwarepaket, das nicht nur die Kolonien zählt, sondern auch ihre Größenverteilungen aufzeichnet, was eine weitere Ebene nützlicher Informationen über das Zellverhalten darstellt (siehe Abbildung 2a).6

Eine Alternative zum Zählen und Quantifizieren einzelner Kolonien ist die Bestimmung des prozentualen Anteils der von Kolonien bedeckten Fläche der Vertiefung (prozentualer Anteil der Koloniefläche), um das Wachstum klonogener Zellen zu quantifizieren. Guzmán et al. (2014) entwickelten ein frei verfügbares ImageJ-Plugin namens ColonyArea, das genau dies tut (siehe Abbildung 2b).7 Dies ist ein nützliches Werkzeug, wenn Sie verschmolzene Kolonien haben, die mit dem Auge oder einer Koloniezählsoftware nur schwer zu zählen sind, oder wenn Sie eine schnelle Analysemethode mit hohem Durchsatz wünschen.

Abbildung. 2 | Frei verfügbare Tools zur Messung klonogener Assays. (A) Brzozowska et al. entwickelten eine Software (countPHICS), die Kolonien zählt und die Koloniegröße misst.6 (B) Guzmán et al. entwickelten ein ImageJ-Plugin, ColonyArea, das die Wachstumsfläche der Kolonie und die Färbeintensität quantifiziert.7

Markierungsfreies, nicht endpunktbezogenes, halbautomatisches klonogenes Assay-Protokoll

Eine aktuelle Arbeit von Mayr et al. (2018) beschreibt ein neues und modifiziertes klonogenes Assay-Protokoll, das ein 96-Well-Mikroplattenformat und eine Konfluenzdetektion zur Messung von Kolonien verwendet. Diese Methode ermöglicht umfassende Versuchsaufbauten unter Verwendung einer 96-Well-Platte, sie ist markierungsfrei, hat keinen Färbeendpunkt und die Analyse ist halbautomatisch (Abbildung 3)8. Darüber hinaus zeigte eine zeitaufgelöste, endpunktfreie Konfluenzmessung desselben Wells, dass die halbautomatische Analyse für die Bestimmung der Koloniezahl und der mittleren Größe geeignet ist.

Figure. 3 | Mayr et al. bewerteten das klonogene Wachstum im 96-Well-Format über die Zeit mittels Konfluenzdetektion8. Die Grafik zeigt die Quantifizierung des klonogenen Wachstums zu verschiedenen Zeitpunkten, und die Bilder zeigen spezifische Wells mit Konfluenzdetektion. Grüne Punkte stellen Bereiche dar, die von einem Confluence-Reader erkannt wurden, und orangefarbene Pfeile zeigen verschmolzene Kolonien an.

Diese klonogene Assay-Methode bietet eine zeit- und kosteneffiziente Alternative zum Standardprotokoll für klonogene Assays. Da keine Endpunktfixierung und -färbung erforderlich ist, ermöglicht dieses Protokoll eine kontinuierliche Überwachung und Analyse des klonogenen Wachstums. Darüber hinaus können während des Experiments zusätzliche Informationen über die Kinetik des Koloniewachstums gewonnen werden. Das miniaturisierte Format eröffnet auch die Möglichkeit, teure Behandlungen wie siRNA- oder CRISPR/Cas9-basierte Therapien zu testen, die mit dem für eine 6-Well- oder 24-Well-Platte erforderlichen Behandlungsvolumen nicht durchführbar wären. Letztendlich haben Mayr et al. gezeigt, dass markierungsfreie Mikroskopie mit Konfluenzdetektion eine robuste und praktikable Option zur Messung der Klonogenität ist.

Eine markierungsfreie, endpunktfreie und automatisierte Lösung für Ihre klonogenen Assays ist der CytoSMART Omni mit seinem Algorithmus zur Kolonieerkennung. Die Koloniebildung wird im Laufe der Zeit über eine ganze Vertiefung gemessen, wobei die Anzahl der Kolonien, die Größe und die Zirkularität angezeigt werden. Ihre Zellen müssen den Inkubator nicht verlassen und zelluläre kinetische Informationen während des Prozesses der Koloniebildung können erhalten werden (Abb. 4).

Abbildung 4 | Automatisierte Kolonieerkennung mit dem CytoSMART Omni. HEP-G2-Leberkrebszellen in einer 24-Well-Platte wurden 75 Stunden lang mit dem CytoSMART Omni, der in einem Standard-CO2-Inkubator betrieben wird, abgebildet. Das Bild zeigt ein volles Well, nachdem der Kolonieerkennungsalgorithmus ausgeführt wurde, mit Zellhaufen, die durch die orangefarbene Koloniemaske hervorgehoben werden. Koloniezahl, Größe und Kreisförmigkeit wurden während der gesamten Dauer des Tests gemessen und in den Diagrammen dargestellt.

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