Mechanismen der Resistenz gegen Fluorchinolone und Carbapeneme bei Pseudomonas putida

Abstract

Ziele: Pseudomonas putida ist ein seltener opportunistischer Erreger, der in der Regel gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen empfindlich ist. Die Daten zur Resistenz gegen antimikrobielle Mittel bei klinischen P. putida-Isolaten sind begrenzt.

Patienten und Methoden: Die Empfindlichkeit gegenüber Fluorchinolonen, Carbapenemen und anderen Antibiotika wurde bei fünf klinischen Isolaten von P. putida charakterisiert, die von verschiedenen Patienten mit Harnwegsinfektionen als ursächlichen Erregern gewonnen wurden. Die Resistenz gegen Fluorchinolone und Carbapeneme wurde mit Hilfe von PCR und DNA-Sequenzierung genetisch charakterisiert. Die Profile der äußeren Membranproteine (OMP) wurden durch SDS-PAGE charakterisiert.

Ergebnisse: Vier von fünf Isolaten waren sowohl gegen Fluorchinolone als auch gegen Carbapeneme resistent oder intermediär. Nukleotidsequenzen in den die Chinolonresistenz bestimmenden Regionen legten nahe, dass Aminosäuremutationen wie Thr-83→Ile in GyrA und Glu-469→Asp in GyrB zu einer hohen Resistenz gegen Fluorchinolone beitragen können. Vier Metall-β-Lactamase-produzierende Isolate, die eine Resistenz gegen Carbapeneme aufwiesen, trugen die Metall-β-Lactamase-Gene vom IMP-Typ. Ein kombinierter Effekt von verminderter Produktion von 46 kDa OMP und Metallo-β-Lactamase-Produktion wurde von einem P. putida-Isolat gezeigt, das die höchsten MHKs von Carbapenemen aufwies.

Schlussfolgerungen: Diese Studie identifizierte Mechanismen der Resistenz gegen Fluorchinolone und Carbapeneme in klinischen P. putida-Isolaten.

Einführung

Pseudomonas putida, ein nicht fermentierender gramnegativer Bazillus, ist ein opportunistischer humaner Erreger, der für Bakteriämie und Sepsis bei neonatalen, neutropenischen und Krebspatienten sowie für Harnwegsinfektionen verantwortlich ist.1-4 Obwohl selten, kann P. putida eine Ursache für nosokomiale Infektionen bei geschwächten Wirten sein.3

Die meisten P. putida sind empfindlich gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen wie Carbapenemen, Fluorchinolonen und Aminoglykosiden.5-7 Es wurde jedoch über klinische Isolate von P. putida berichtet, die Metall-β-Lactamasen produzieren, die eine Resistenz gegen β-Lactame, einschließlich Carbapenemen, verleihen.3,4,8,9 Außerdem wurde kürzlich über Metall-β-Lactamase produzierende Isolate berichtet, die neben β-Lactamen auch gegen Ciprofloxacin, Gentamicin und Tobramycin resistent waren.3 Das Auftreten von mehrfach arzneimittelresistenten P. putida ist zu einer Ursache für Schwierigkeiten bei der Behandlung von Infektionen geworden und stellt ein Risiko für die nosokomiale Übertragung dar.

In einigen früheren Studien wurde die Antibiotikaresistenz von P. putida im Hinblick auf die Produktion von Metall-β-Laktamasen und die Merkmale von Effluxsystemen charakterisiert.3,4,8-12 Carbapenem-resistente P. putida produzieren nach Berichten aus Europa, Korea und Japan häufig Metall-β-Lactamasen vom IMP- und VIM-Typ.3,4,8,9,9a Effluxsysteme wie TtgABC, MepABC, TtgDEF und ArpABC können ebenfalls zur Mehrfachresistenz bei P. putida beitragen.10-12Pseudomonas aeruginosa hat die Fähigkeit, im Laufe der Behandlung schnell resistent zu werden,13 ob P. putida das gleiche Potenzial besitzt, ist jedoch unklar. Um das Risiko des Auftretens einer Antibiotikaresistenz abschätzen zu können, sind umfangreiche Daten zur Resistenz gegen antimikrobielle Mittel bei klinischen P. putida-Isolaten erforderlich. In dieser Studie haben wir die Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen, einschließlich Fluorchinolonen und Carbapenemen, bestimmt und die Mechanismen der Resistenz gegenüber Fluorchinolonen und Carbapenemen in klinischen P. putida-Isolaten charakterisiert, die als Erreger von Harnwegsinfektionen während eines Zeitraums von einem Jahr in unserem Krankenhaus gewonnen wurden.

Patienten und Methoden

Patienten

Fünf Patienten (vier Männer und eine Frau), bei denen akute, wiederholte oder chronische Harnwegsinfektionen durch P. putida am Hamamatsu University Hospital diagnostiziert wurden, wurden von Oktober 2001 bis September 2002 in unsere Studie aufgenommen.

Bakterienstämme und mikrobiologische Methoden

Bei den in dieser Studie verwendeten Stämmen handelte es sich um fünf klinische Isolate von P. putida, die von verschiedenen Patienten als ursächliche Erreger gewonnen wurden. Die Identifizierung erfolgte durch biochemische Standardtests in unserem klinischen Mikrobiologielabor. Alle Isolate wurden aus Urin gewonnen. Die SpeI-begrenzten Fragmentmuster der chromosomalen DNA dieser fünf Isolate waren unterschiedlich (Abbildung 1). Die Bakterien wurden bei -70 °C in Herzinfusionsbrühe (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japan) mit 20 % Glycerin gelagert. Anschließend wurden die Bakterien auf Herzinfusionsagarplatten (Nissui Pharmaceutical) beimpft und über Nacht bei 37°C bebrütet. Die MHKs wurden mit einer Agarverdünnungsmethode gemäß der Beschreibung des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ehemals National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), bestimmt.14 Die Empfindlichkeitstests wurden mit Mueller-Hinton-Agar (Nippon Becton Dickinson, Tokio, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die MHK-Interpretationskriterien für Ceftazidim, Imipenem, Meropenem, Norfloxacin, Levofloxacin, Gatifloxacin, Gentamicin, Amikacin und Minocyclin folgten denen der CLSI/NCCLS.14 MHK-Breakpoints anderer antimikrobieller Mittel wurden nicht definiert.

Antimikrobielle Mittel

Amplifikation und DNA-Sequenzierung von Chinolon-Resistenz-bestimmenden Regionen

Chromosomale DNA wurde aus P. putida-Isolaten wie zuvor beschrieben extrahiert.15 Die PCR-Amplifikation wurde mit spezifischen Primer-Sets durchgeführt. Ein Primer-Set aus 5′-gacggcctgaagccggtgcac-3′ und 5′-gcccacggcgataccgctgga-3′ amplifizierte ein 417 bp-Fragment der Chinolonresistenz-bestimmenden Regionen (QRDRs) des gyrA-Gens von den Positionen 115 bis 531.16 Ein Primer-Set aus 5′-agtacttcgccgacttcct-3′ und 5′-tacaggcgcgacaggcgctt-3′ amplifizierte ein 739 bp-Fragment der QRDRs des gyrB-Gens von den Positionen 1073 bis 1811.17 Ein Primer-Set aus 5′-tctacgccatgagcgaactgg-3′ und 5′-agcagcacctcggaatagcg-3′ amplifizierte ein 262 bp langes Fragment der QRDRs des parC-Gens von den Positionen 158 bis 419.18 Die Amplifikationen wurden mit dem Advantage-GC2-Enzym (BD Biosciences Clontech Japan, Tokio, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die QRDRs wurden mit einem BigDye Terminator v3.0 Taq Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mit AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) und einem automatischen DNA-Sequenzierungssystem (ABI PRISM 310 genetic analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert.

Genetischer Nachweis von Metallo-β-Lactamase-Genen

Zubereitung von Außenmembranproteinen

Außenmembranproteine (OMPs) wurden wie zuvor beschrieben hergestellt.21 Die Proben wurden mittels SDS-PAGE analysiert.

Ergebnisse

Empfindlichkeit

Die Ergebnisse der Empfindlichkeitstests für Fluorchinolone und Carbapeneme sind in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2 zusammengefasst. Die MHKs der β-Lactame reichten von >128 mg/L für Ampicillin und Cefaloridin, 2 bis >128 mg/L für Ceftazidim, 1 bis 128 mg/L für Imipenem, 0,5 bis >128 mg/L für Panipenem, 4 bis >128 mg/L für Meropenem und 1 bis >128 mg/L für Biapenem. Die MHK-Bereiche von Aminoglykosiden und Minocyclin waren wie folgt: 0,25 bis 8 mg/L für Gentamicin, 0,5 bis 8 mg/L für Amikacin, 0,5 bis 1 mg/L für Kanamycin und 4 bis 64 mg/L für Minocyclin. Vier Isolate waren sowohl gegen Fluorchinolone als auch gegen Carbapeneme resistent oder intermediär, während ein Isolat, HU2001-429, sowohl für β-Laktame als auch für Fluorchinolone empfindlich war. Drei P. putida-Isolate, HU2001-412, HU2001-419 und HU2001-451, zeigten Resistenz gegen alle untersuchten β-Laktame wie Ceftazidim, Imipenem und Meropenem. Drei Isolate, HU2001-412, HU2001-419 und HU2002-467, wiesen eine hohe Resistenz gegen Fluorchinolone (>128 mg/L) auf, darunter Norfloxacin, Levofloxacin, Sparfloxacin, Gatifloxacin und Pazufloxacin, sowie eine Resistenz gegen Minocyclin (32 bis 64 mg/L). Bei den fünf Isolaten lag der MHK-Bereich für Sitafloxacin zwischen ≤0,125 und 8 mg/L.

Fluorchinolon-Resistenz

Carbapenem-Resistenz

Von fünf P. putida-Isolaten trugen vier mit Carbapenem-Resistenz das IMP-Typ-Metallo-β-Laktamase-Gen, während die VIM-Typ-Metallo-β-Laktamase-Gene durch PCR nicht nachgewiesen wurden (Tabelle 2). Die MHK-Bereiche von Carbapenemen bei P. putida, die Metall-β-Lactamase-Gene vom IMP-Typ tragen, waren wie folgt: 8 bis 128 mg/L für Imipenem, 32 bis >128 mg/L für Panipenem, 128 mg/L oder mehr für Meropenem und 32 bis >128 mg/L für Biapenem. Bei P. putida HU2001-451, das unter den fünf Isolaten die höchsten MHKs für Carbapeneme aufwies, war die Produktion von 46 kDa OMP durch SDS-PAGE nicht nachweisbar, während die Produktion von P. putida HU2001-412, HU2001-419, HU2001-429 und HU2002-467 in ähnlicher Weise nachgewiesen wurde (Tabelle 2).

Diskussion

In dieser Studie haben wir die Empfindlichkeit von fünf klinischen Isolaten von P. putida, die von verschiedenen Patienten mit akuten, wiederholten oder chronischen Harnwegsinfektionen isoliert wurden, gegenüber Fluorchinolonen und Carbapenemen untersucht. Alle fünf Isolate wiesen unterschiedliche PFGE-Genotypen auf, was darauf schließen lässt, dass keine der von diesen P. putida verursachten Infektionen nosokomial war. Vier der fünf Isolate waren resistent oder intermediär sowohl gegen Fluorchinolone als auch gegen Carbapeneme. Drei Isolate zeigten eine hohe Resistenz (>128 mg/L) gegen alle untersuchten Fluorchinolone mit Ausnahme von Sitafloxacin. Unter den in dieser Studie untersuchten Fluorchinolonen zeigte Sitafloxacin eine überlegene Wirksamkeit gegen die P. putida-Isolate. Diese gegen Fluorchinolone hochgradig resistenten Isolate waren auch gegen Carbapeneme und Minocyclin resistent. Alle Isolate waren empfindlich gegenüber Aminoglykosiden wie Amikacin.

Studien zur Fluorchinolon-Resistenz bei P. putida sind begrenzt.6,12 Bei P. aeruginosa gehören zu den Hauptmechanismen, die für die Fluorchinolon-Resistenz verantwortlich sind, Aminosäure-Mutationen in der DNA-Gyrase oder Topoisomerase IV, die durch Mutationen in den QRDRs von GyrA und ParC verursacht werden, während einige Berichte auf eine Beteiligung von Mutationen von GyrB an der Fluorchinolon-Resistenz hinweisen.18,22 Ein sekundärer Resistenzmechanismus in P. aeruginosa, der Effluxsysteme einbezieht, trägt zu einer verminderten Anfälligkeit gegenüber Fluorchinolonen bei.22,23 In dieser Studie wurden Aminosäureveränderungen in den QRDRs von GyrA, GyrB und ParC zwischen fünf klinischen Isolaten von P. putida verglichen. Fluorchinolon-resistente P. putida wiesen zusätzliche Mutationen wie Thr-83→Ile in GyrA und Glu-469→Asp in GyrB auf, die den Mutationen entsprachen, die in fluorchinolon-resistenten P. aeruginosa gefunden wurden.22,23 Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Aminosäuremutationen in den QRDRs wie Thr-83→Ile in GyrA und Glu-469→Asp in GyrB zu einer hohen Resistenz gegen Fluorchinolone beitragen können, obwohl nicht ermittelt wurde, ob die Transformation von Plasmiden mit Wildtyp-GyrA-, GyrB- oder parC-Genen in solche Isolate die MHKs von Fluorchinolonen senken würde.24 Der MHK-Bereich von Sitafloxacin lag bei den fünf P. putida-Isolaten zwischen ≤0,125 und 8 mg/L. Obwohl frühere Berichte gezeigt haben, dass eine Überexpression der TtgABC-, MepABC-, TtgDEF- und ArpABC-Effluxsysteme ebenfalls zur Mehrfachresistenz von P. putida beitragen kann,10,11,12 blieb die Rolle der Effluxsysteme in dieser Studie unklar.

Eine Carbapenem-Resistenz bei P. putida, die durch die Produktion von Metall-β-Lactamasen verursacht wird, wurde berichtet.3,4,8,9,9a Diese Metall-β-Lactamasen, die in P. putida gefunden wurden, umfassten IMP- und VIM-Typen.3,4,8,9,9a Bei den vier Carbapenem-resistenten P. putida wurde die Produktion von Metall-β-Lactamasen durch eine Scheibendiffusionsmethode nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Diese Isolate trugen die Metall-β-Lactamase-Gene vom IMP-Typ, während die Metall-β-Lactamase-Gene vom VIM-Typ nicht durch PCR nachgewiesen wurden. Die Prävalenz von Metall-β-Lactamase produzierenden P. putida ist ein wichtiges klinisches Problem und stellt ein Reservoir genetischer Determinanten der β-Lactam-Resistenz dar. Zu den anderen wichtigen Mechanismen der Carbapenem-Resistenz bei P. aeruginosa gehören die mutationsbedingte Undurchlässigkeit, die durch den Verlust von OprD – einem porinbildenden Transmembrankanal, der für Carbapeneme, aber nicht für andere β-Lactame zugänglich ist – entsteht, und die Produktion von Metall-β-Lactamasen.21,25,26 Der Verlust von OprD führt bei P. aeruginosa zu einer Resistenz gegen Imipenem und zu einer verminderten Anfälligkeit für Meropenem.27 Bei P. putida HU2001-451, das unter vier Carbapenem-resistenten Isolaten die höchsten MHKs (≥128 mg/L) aller Carbapeneme aufwies, war die Produktion von 46 kDa OMP im Vergleich zu den anderen Isolaten reduziert. Die OMP-Profile von P. putida HU2001-451 ähnelten denen von Carbapenem-resistentem P. aeruginosa, bei dem in unserer früheren Studie eine verminderte Produktion von OprD festgestellt wurde.21 Diese Ergebnisse zeigten einen kombinierten Effekt der verminderten Produktion von 46 kDa OMP neben der Produktion von Metall-β-Lactamasen auf die Carbapenem-Resistenz in dem Isolat, obwohl unklar war, ob andere β-Lactamasen für die Carbapenem-Resistenz relevant waren.

Zusammenfassend haben wir die Fluorchinolon- und Carbapenem-Resistenz in klinischen Isolaten von P. putida charakterisiert. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Aminosäuremutationen in den QRDRs, wie Thr-83→Ile in GyrA und Glu-469→Asp in GyrB, zur hohen Resistenz gegen Fluorchinolone in P. putida beitragen können. Vier Metall-β-Lactamase produzierende P. putida-Isolate, die eine Resistenz gegen Carbapeneme aufwiesen, trugen das IMP-Typ Metall-β-Lactamase-Gen. Wir fanden einen kombinierten Effekt von verminderter Produktion von 46 kDa OMP und Produktion von Metallo-β-Lactamasen, der die Carbapenem-Resistenz in einem Isolat von P. putida verstärkte, das die höchsten MHKs von Carbapenemen aufwies.

Wir danken Miroku Medical Laboratory, Saku, Nagano, Japan, für die PFGE-Analyse. T. H. wird durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research (17790353) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie unterstützt.

Autorenhinweise

1Abteilung für Labormedizin, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 2Group of Infection Control Research, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 3Division of Pharmacy, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handa-yama, Hamamatsu 431-3192, Japan; 4Department of Clinical Laboratory Medicine, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 54 Shogoin-Kawahara-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japan