Molekulare MedizinBerichte

Einführung

Pestizide sind Substanzen oder Substanzgemische, die zur Vorbeugung, Vernichtung, Abwehr oder Milderung von Schädlingen wie Insekten, Nagetieren, Unkraut und anderen unerwünschten Organismen verwendet werden (1,2). Daher hat der weltweite Einsatz von Pestiziden, insbesondere in der Landwirtschaft, in den letzten Jahren in ländlichen Gebieten zugenommen. In der extensiven landwirtschaftlichen Produktion werden Pestizide in großem Umfang eingesetzt; ihre Rückstände verschmutzen Luft, Boden, Wasser, Pflanzen, Ernteprodukte, Geräte, Kleidung sowie das Gewebe von Mensch und Tier. Die ausgebrachten Pestizide gelangen durch Einatmen, Verschlucken und Hautresorption in den menschlichen Körper und können Vergiftungen verursachen(2-4). Das Ausmaß der verursachten Schäden hängt von der intrinsischen Toxizität der Substanzen und dem individuellen Gesundheitszustand und der Empfindlichkeit ab (2, 4-6). Die Exposition gegenüber Pestiziden stellt ein potenzielles Gesundheitsrisiko für die allgemeine Bevölkerung und insbesondere für landwirtschaftliche Arbeitnehmer dar (7-12).

Viele Studien haben sich auf den Zusammenhang zwischen der Exposition gegenüber Pestiziden und dem Auftreten von Krebserkrankungen wie Sarkomen, multiplem Myelom, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Leukämie konzentriert (13-21). Einige Forscher haben festgestellt, dass die berufliche Exposition gegenüber Pestiziden mit dem Risiko eines Non-Hodgkins-Lymphoms (NHL) in Verbindung gebracht wird (22-24).NHL ist eine heterogene Gruppe von lymphoproliferativen Malignomen, die von B- oder T-Lymphozyten ausgehen können. Reziproke Rearrangements von B-Zell-Immunglobulin- oder T-Zell-Rezeptor-Genen treten mit Onkogenen in unreifen lymphatischen Zellen im Knochenmark oder in reiferen Zellen in den peripheren lymphatischen Organen auf (25, 26). Diese chromosomalen Translokationen führen häufig zu einer Überexpression von Onkogenen und bewirken, dass die Zellen bösartig werden und sich unkontrolliert vermehren (26).

Die chromosomale Translokation t(14;18)(q32;q21) ist eine der häufigsten Chromosomenanomalien bei NHL, die in 70-90% der Fälle von follikulärem Lymphom (FL), 20-30% des diffusen großzelligen B-Zell-Lymphoms und 5-10% anderer weniger verbreiteter Subtypen auftritt (27). Darüber hinaus wurde eine erhöhte Prävalenz der chromosomalen Translokationt(14;18)(q32;q21) in peripheren Blutlymphozyten von Personen festgestellt, die beruflich Pestiziden ausgesetzt sind (28,29).

Das Ziel dieser Studie ist es, die Auswirkungen von Pestiziden auf die t(14;18)-Chromosomentranslokation bei Landarbeitern nach kurzfristiger Exposition zu ermitteln.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Das Forschungsprotokoll wurde von der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses Catania (Catania, Italien) genehmigt und die schriftliche Einwilligung aller Probanden wurde vor ihrer Aufnahme in die Studie eingeholt.

Studiendesign und Pestizidexposition

Es handelte sich um eine Fall-Kontroll-Studie, die in der Provinz Ragusa (Sizilien, Italien) mit einer Bevölkerung von ~320.000 Einwohnern durchgeführt wurde. Es handelt sich um einen stark landwirtschaftlich geprägten Bezirk, in dem ein Großteil der Bevölkerung in ~25.000 landwirtschaftlichen Betrieben beschäftigt ist, die Obst und Gemüse in Gewächshäusern sowie Produkte aus der Tierhaltung erzeugen. Bei all diesen Tätigkeiten werden große Mengen an Pestiziden eingesetzt. Die wichtigsten Kulturen sind Karotten, Kartoffeln und Zucchini im Freiland und Tomaten, Auberginen, Paprika und Zucchini in Gewächshäusern (30).

Zweiundfünfzig Arbeitnehmer, die beruflich Pestiziden ausgesetzt sind, und 52 nicht exponierte wurden rekrutiert. Die exponierten Arbeiter, die an dieser Studie teilnahmen, führten ihre Arbeit mit Sicherheitsschutzvorrichtungen (SPD) aus: Handschuhe, Masken, Overalls und Schutzbrillen. Die Ausbringung der Pestizide erfolgte 5-6 Mal pro Woche und dauerte 6-7 Arbeitsstunden. Nicht exponierte Arbeitnehmer (Kontrolle) kamen nicht mit Pestiziden in Berührung. Die exponierten Arbeitnehmer wurden saisonal (April bis August) für den Anbau von Gewächshaustomaten eingestellt.Tabelle I zeigt die von den exponierten Arbeitnehmern verwendeten Pestizide. Es war nicht möglich, expositionsbiologische Marker in Bezug auf die verwendeten Pestizide nachzuweisen.

Tabelle I. Pestizide, die im Gewächshaus beim Anbau von Tomaten verwendet wurden.

Ein strukturierter Fragebogen zur Untersuchung von Umwelt- und Berufsrisiken wurde von geschulten Interviewern ausgefüllt, um genaue Daten zu Demografie, Krankengeschichte, Gesundheitsgewohnheiten und Exposition gegenüber Pestiziden und/oder anderen Chemikalien zu erfassen. Ausschlusskriterien waren Diabetes, Bluthochdruck, Schilddrüsen-, Leber-, Nieren-, Lungen- und hämatologische Erkrankungen.

t(14;18)-(IgH;Bcl-2)Translokation

Periphere Blutproben (10 ml/Proband) wurden in Vacutainer-EDTA (K2)-Röhrchen (BD Biosciences, FranklinLakes, NJ, USA) gesammelt. Die DNA wurde aus den im Buffy-Coat enthaltenen PBMCs gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.

t(14;18)-(IgH;Bcl-2)-Translokation, in der Major-Breakpoint-Region (MBR) und Minor-Cluster-Region (mcr), wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie zuvor berichtet (31) bestimmt. AccuPrime™SuperMix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) wurde verwendet, um die Spezifität und Empfindlichkeit der PCR-Analyse zu erhöhen. Die Empfindlichkeit unseres Assays betrug 10-5.

Die Integrität der DNA jeder Probe wurde durch die PCR-Vervielfältigung eines 430 bp-Fragments des Wachstumshormon(GH)-Gens überprüft. Die für die GH-Amplifikation verwendeten Vorwärts- und Rückwärtsprimer-Sequenzen waren: 5-CACCATTACATCCCACCT-3 bzw. 5-GCTTCTTGCTTGAGTGA-3. Die für die GH-Amplifikation verwendeten PCR-Bedingungen waren identisch mit denen, die für den MBR berichtet wurden(31).

Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 2,5%igen Agarosegel getrennt. Einzelne Banden, die durch die Amplifikation der MBR und MCR aus Blutproben erhalten wurden, wurden vom Gel gereinigt und dann auf einemABI 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) sequenziert, wie zuvor berichtet (31).

Statistische Analyse

Daten wurden als Mittelwert ± SD für kontinuierliche Variablen und Häufigkeiten für kategorische Variablen zusammengefasst. Die Normalität wurde mit dem Kolmogrov-Smirnov-Test und die Homogenität der Varianz mit dem Levenes-Test geprüft. Die logistische Regression wurde verwendet, um das Vorhandensein der Translokation t(14;18) bei Arbeitern, die Pestiziden ausgesetzt sind, Rauchern und Alkoholkonsumenten zu bewerten. Die Datenanalyse wurde mit GraphPad Prism Version 7.0 (GraphPad Software,Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt.

Ergebnisse

Die exponierte Gruppe wies ähnliche Merkmale auf wie die nicht-exponierte. Insbesondere waren alle Probanden männlich, und es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede in Bezug auf Alter, BMI, Rauchgewohnheiten, Alkoholkonsum, Arbeitsalter und Sonnenlichtexposition.

Die Landarbeiter waren im Durchschnitt 5 Jahre lang ~3,7 Stunden pro Tag Pestiziden ausgesetzt. Tabelle II enthält die wichtigsten Merkmale der Stichprobe; Abb. 1.

Tabelle II. Merkmale der Studienpopulationausgedrückt als Häufigkeit oder Mittelwert ± SD.

Die Häufigkeit der BCL2-IGH t(14;18)-Translokation bei Arbeitern, die beruflich Pestiziden ausgesetzt sind, betrug 10 % (5 von 52) gegenüber 8% (4 von 52) in der Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigten einen nicht signifikanten Zusammenhang zwischen der beruflichen Exposition gegenüber Pestiziden und einer erhöhten Häufigkeit der ChromosomentranslokationBCL2-IGH t(14;18) bei Landwirten (Tabelle III).

Tabelle III. Logistische Regression t(14;18)Chromosomentranslokation.

Außerdem war es nicht möglich, die Häufigkeit von t(14;18) in Bezug auf die Art der verwendeten Pestizide zu bewerten, da alle Probanden Insektiziden und Fungiziden ausgesetzt waren.

Diskussion

Die chromosomale Translokation t(14;18)(q32;q21) ist eine der häufigsten Chromosomenanomalien bei NHL. Diese Translokation betrifft zwei spezifische Loci, den Locus für die schwere Immunglobulinkette (IgH) auf Chromosom 14q32 und den Locus für B-Zell-Leukämie/Lymphom 2 (BCL2) auf Chromosom 18q2l (32).

Bei dem typischen Translokationsprozess wird das BCL2-Gen auf Chromosom 18 an das transkriptionell aktive IgH-Gen auf Chromosom 14 angehängt, was zu einer Überexpression des ersteren führt. Infolgedessen erhöht die verstärkte anti-apoptotische Funktion von BCL2 das Überleben der Zellen, was einen frühen Schritt im malignen Prozess von NHL darstellt (32-34).

Eine erhöhte Inzidenz von NHL wurde bei Landwirten und anderen Berufsgruppen, die mit Pestiziden arbeiten, festgestellt (35). Darüber hinaus wurde eine erhöhte Prävalenz der chromosomalen Translokation t(14;18)(q32;q21) in peripheren Blutlymphozyten von Personen festgestellt, die beruflich mit Pestiziden in Berührung kamen (29,36,37).

In einer kürzlich durchgeführten Studie mit 96 Landarbeitern fanden Qaqish et al. (1) heraus, dass die berufliche Exposition gegenüber Pestiziden in der Freilandwirtschaft und Insektiziden, die bei Tieren eingesetzt werden, die Häufigkeit der chromosomalen Translokation t(14;18) erhöht. Bei Landwirten, die beruflich Pestiziden und Insektiziden ausgesetzt waren, war die Wahrscheinlichkeit, t(14;18) zu tragen, 13,5 Mal höher. Stattdessen trugen 63,5 % (61 von 96) der Landwirte im Vergleich zu 11,5 % (11 von 96) der Kontrollpersonen die Translokation.

In unserer Studie betrug die BCL2-IGH t(14;18)-Translokationshäufigkeit bei Arbeitern, die beruflich Pestiziden ausgesetzt sind, 10 % (5 von 52) gegenüber 8% (4 von 52) in der Kontrollgruppe, ohne signifikante statistische Unterschiede.

Die Diskrepanz zwischen unseren Ergebnissen und denen von Qaqishet al (1) kann auf die geringere Dauer der Exposition (50%) im Vergleich zu letzteren zurückgeführt werden (10,9±7,9 vs. 5,1±0,8 Jahre).

Außerdem benutzten in unserer Stichprobe alle Arbeiter Standard-SPDs, während in Qaqish et al. (1) nur 2,1 % der Landwirte Masken und 27,1 % Masken und Handschuhe benutzten.

Wie Qaqish et al. (1) gezeigt haben, kann die Verwendung von SPDs dazu beitragen, t(14;18) zu verhindern.Das t(14;18)-Risiko wurde signifikant mit der Exposition gegenüber verschiedenen Arten von Pestiziden in Verbindung gebracht: Insektizide, Herbizide und Duftstoffe (28).

Chiu et al. (28) stellten fest, dass die Verwendung von Insektiziden und Herbiziden mit einem 2,6- bis 3-fach höheren Risiko für t(14;18)-positive NHL verbunden war. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Erkenntnissen aus früheren Studien, in denen Pestizide spezifisch mit follikulärem NHL (23, 38-40) assoziiert waren, das in der Regel positiv für t(14;18) ist.

Chiu et al. (28) und Schroeder et al. (41) fanden heraus, dass das NHL-Risiko im Zusammenhang mit der Landwirtschaft und der Exposition gegenüber Dieldrin, Lindan, Atrazin oder Fungiziden mit t(14;18) assoziiert war.

In Italien wurde die Verwendung von Pestiziden wie Dieldrin, Lindan und Atrazin vor langer Zeit verboten. Außerdem waren die exponierten Probanden in unserer Studie sowohl Fungiziden (Propamocarbhydrochlorid, Metalaxyl-M, Cyproconazol) als auch Insektiziden (Thiamethoxam, Deltamathrin, Acrinathrin und Abamectin) ausgesetzt, so dass die Wirkung der einzelnen Mittel nicht differenziert werden konnte.

Die Ergebnisse unserer Studie stehen im Einklang mit den Beobachtungen anderer Forscher (1,28), die ein erhöhtes Risiko bei längerer Anwendung von Insektiziden und Herbiziden und im Zusammenhang mit der Verwendung von SPDs festgestellt haben.

Wir haben die Auswirkungen potenzieller Störfaktoren auf die Häufigkeit der BCL2-IGH t(14;18)-Translokation untersucht. Erstens trug der Alkoholkonsum nicht zur Häufigkeit der Entdeckung bei, was möglicherweise auf den geringen Alkoholkonsum in unserer Studiengruppe zurückzuführen ist (17,6±8,5 vs. 18,7±7,7 g/Tag bei Exponierten bzw. Nicht-Exponierten). Darüber hinaus konnten wir keinen Zusammenhang zwischen dem Alter der Proben und der Häufigkeit des Nachweises einer BCL2-IGH t(14;18)-Translokation feststellen (1,29).

Unsere Studie sowie Roulland et al. (29) und Qaqish et al. (1) schlossen Probanden mit einem Durchschnittsalter von <50 Jahren ein, wobei ein Zusammenhang mit dem Alter nur bei Proben im Alter von über 60 (42) und 70 Jahren (43) festgestellt wurde. Außerdem erhöhte Zigarettenrauchen die Häufigkeit der BCL2-IGHt(14;18)-Translokation in unserer Stichprobe nicht, was mit einer früheren Studie (28) übereinstimmt. Darüber hinaus zeigte die Exposition gegenüber Sonnenlicht keine Auswirkung auf die Häufigkeit der t(14:18)-Nachweise, was mit anderen Studien übereinstimmt (29).

Aus den Ergebnissen unserer Studie kann daher geschlossen werden, dass die konstante Verwendung gesetzlich vorgeschriebener SPDs und die Dauer der Exposition einen Einfluss auf die Häufigkeit von Translokationen bei Pestizid-exponierten Arbeitnehmern haben können.

Unsere Studie soll mit einer Nachbeobachtung dieser Arbeitnehmer fortgesetzt werden, um die Rolle des Faktors „Expositionszeit“ auf die Gentranslokation besser bestimmen zu können.