Reinigung von einzelsträngiger DNA durch Co-Polymerisation mit Acrylamid und Elektrophorese

Einstrangige DNA (ssDNA) ist nützlich für Aptamere (1), Selbstorganisation (2), DNA-Origami (3), DNA-Schaltungen (4), Hybridisierungssonden (5) und DNA-Robotik (6). Chemisch synthetisierte DNA ist standardmäßig einzelsträngig.

Hier stellen wir eine Methode zur Herstellung von ssDNA aus einem PCR-Produkt vor. Die Verwendung eines PCR-Produkts anstelle von synthetischer DNA kann vorteilhaft sein, da die PCR weniger Mutationen einführt als die chemische Synthese und DNAs erzeugen kann, die länger sind als die ∼120 Basengrenze der chemischen Synthese. Ausgehend von einer klonalen Probe können PCR-Produkte auch eine wesentlich höhere Sequenzreinheit aufweisen als chemisch synthetisierte DNA. Eine hohe Sequenzreinheit ist entscheidend für eine hohe Leistung in der DNA-Schaltungstechnologie (7).

Unsere Einzelstranggenerierungsmethode (SSG) ist skalierbar und erfordert nur einen Reinigungsschritt. Dabei wird der unerwünschte komplementäre Strang entfernt und eine größenbasierte Reinigung von restlichen Primern und unerwünschten PCR-Produkten durchgeführt. SSG durch Co-Polymerisation und Elektrophorese kann auf das Produkt fortgeschrittener PCR-Protokolle wie Gibson Assembly (8) angewandt werden, um lange, einzelsträngige Produkte beliebiger Sequenz zu erzeugen. Dies kann für DNA-Origami und andere Anwendungen der Selbstmontage von Nutzen sein.

SSG nutzt eine kommerziell erhältliche DNA-Modifikation, die als Acrydit bekannt ist. Diese Modifikation fügt eine polymerisierbare Vinylgruppe hinzu, die sich in eine wachsende Acrylamid-Polymerkette einfügt (9). Mit Acrydit modifizierte DNA wurde bereits für eine Reihe von Anwendungen eingesetzt, darunter ein schaltbares Hydrogel (10), das Einfangen von Quecksilber (11) oder PDGF (12) und die Modifizierung der Elektrophoreserate bestimmter Sequenzen (13). Unsere Technik ähnelt oberflächlich betrachtet der Methode, mit der die Church-Gruppe Polymerase-Kolonien in dünnen Polyacrylamid-Gelen immobilisiert hat. Das Acrydit ist entscheidend für die Bildung klonaler PCR-Produkte (Polonien) bei einigen Formen der DNA-Sequenzierung (14).

In Fällen, in denen erhebliche Mengen an reiner ssDNA benötigt werden, ist unser Ansatz mit Acrydit-modifizierten Primern und Polyacrylamid-Immobilisierung eine lohnende Option. Wir zeigen auch, dass diese Technik SSG, Größentrennung und Elektroelution in einem einzigen Schritt integrieren kann.

Materialien und Methoden

Wenn nicht anders angegeben, wurden die Reagenzien von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) bezogen und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die DNA wurde von IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) erworben und ohne weitere Reinigung verwendet (Sequenzinformationen siehe ergänzende Tabelle S1).

Demonstration des Einfangens des Acrydit-Strangs

Für den anfänglichen Nachweis von SSG durch Co-Polymerisation mit Acrylamid und anschließende Elektrophorese modifizierten wir einen Primer mit Acrydit und rotem Fluoreszenzfarbstoff Cy5. Der andere Primer wurde mit einer grün fluoreszierenden 5′-Fluorescein-Modifikation erworben. Abbildung 1 zeigt, wie die DNA-Probe durch Mischen von 100 μl 10% denaturierendem Gel (Präpolymer vor Beginn der Polymerisation) mit 100 μl PCR-Produkt (∼20 pMol Produkt) und der entsprechenden Menge trockenen Harnstoffs (5% Acrylamid-Endkonzentration, 7 M Harnstoff-Endkonzentration) hergestellt wurde. Die DNA/Prepolymer wurde in eine trockene Vertiefung eines 5% denaturierenden PAGE-Gels gegeben. Das Gel wurde wie unten beschrieben erhitzt, und die Elektrophorese wurde durchgeführt, um den grün fluoreszierenden Strang vom immobilisierten rot fluoreszierenden Strang zu trennen. Das resultierende Gel wurde mit einem Standard-Gel-Imaging-System mit LED-Beleuchtung (FluorChem Imaging System, Protein-Simple, San Jose, CA) abgebildet.

Erzeugung und Reinigung von Einzelsträngen (vertikale Gelelektrophorese)

Die PCR wurde in allen Fällen mit dem Accuprime Pfx-Reaktionskit (Life Technologies, Grand Island, NY) unter Verwendung von 50 nM Template, 10 μM jedes Primers und 8 Thermozyklen durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde durch Zugabe von festem Harnstoff mit einer Endkonzentration von 7 M in einer 100-μl-Reaktion denaturiert. Polyacrylamid wurde aus einer kommerziell erhältlichen Stammlösung von 40 % Acrylamid in Wasser mit einem Verhältnis von 19:1 Acrylamid:Bis-Acrylamid (Bio-Rad, Hercules, CA) hergestellt. Denaturierendes Polyacrylamid wurde mit Endkonzentrationen von 7 M Harnstoff, 20 % Acrylamid und 0,25× TBE-Puffer hergestellt. Die Polymerisation wurde durch Zugabe von 1 μl TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin) und 10 μl 10 % Ammoniumpersulfat zu einem Aliquot von 1 ml denaturierendem Acrylamid-Prepolymer eingeleitet. Ein Teil dieser Mischung (Präpolymer vor Beginn der Polymerisation) wurde rasch im Verhältnis 1:1 mit 100 μl PCR-Produkt (fünf 20-μl-PCR-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers, gepoolt) mit 7 M Harnstoff (10 % Acrylamid, Endkonzentration) gemischt. Die PCR/Polymerisations-Acrylamid-Mischung wurde in eine trockene Vertiefung in einem vertikalen denaturierenden PAGE-Standardgel gegeben. Die vollständige Polymerisation des PCR/Denaturierungsacrylamids wurde durch Spülen des Raums über der Vertiefung mit einem sanften Argon- oder 99,97%igen Stickstoffstrom sichergestellt (um jeglichen Sauerstoff zu verdrängen, der die Polymerisation hemmt). Nach ∼30 Minuten Polymerisation wurde die Elektrophoreseanlage aufgebaut. Die Zerkleinerung des Polyacrylamids und das Einbringen der mazerierten Stücke in die Vertiefung ergab eine sehr breite, unregelmäßig geformte Bande, so dass dieser Ansatz aufgegeben wurde (Daten nicht gezeigt). Die Polymerisation innerhalb der Vertiefung war ein besserer Ansatz. Wir erhitzten den Laufpuffer in der Mikrowelle bis zum Sieden und gaben den heißen (∼80°C-90°C) Puffer in das Kathodenreservoir (indem wir den heißen Puffer über die gefüllten Vertiefungen gossen), um die Freisetzung der DNA aus der Vertiefung zu fördern. Die Zugabe des heißen Puffers wurde so lange fortgesetzt, bis die Gelanlage bis zum für die Elektrophorese erforderlichen Volumen gefüllt war. Das DNA-haltige Gel kam beim Anlegen der Spannung in direkten Kontakt mit dem heißen Puffer. Der heiße Puffer sollte sofort zugeführt werden und nicht abkühlen dürfen. Anschließend führten wir die Elektrophorese nach dem in Abbildung 1 gezeigten Schema durch.

SB (5 mM Natriumborat) und TBE-Puffer können als Laufpuffer verwendet werden. SB und TBE wurden bei RT bei pH 8,42 bzw. 8,36 hergestellt. Bei 80°C ändern sich diese pH-Werte auf 8,21 bzw. 7,47. Diese pH-Änderung ist vorübergehend. Das Gel kühlt während der Elektrophorese auf 30°C-40°C ab. Diese pH-Änderung führte nicht zu einem merklichen Abbau der DNA.

Um die Trennung der beiden Stränge sichtbar zu machen, verwendeten wir Primer, die mit zwei verschiedenen Fluorophoren modifiziert waren. Der mobile Strang wurde mit einem Fluorescein-modifizierten Primer erzeugt. Der Primer (Acrydit) für den unbeweglichen Strang wurde mit einer internen Cy5-Modifikation hergestellt. Mit diesen beiden Farbstoffen konnten wir den Fortschritt der Trennung sichtbar machen. Wir scannten dieses Gel mit einem Gel-Imager (FluorChem Q, ProteinSimple, Santa Clara, CA) nach 45 Minuten Elektrophorese bei 500 V.

Alternativ kann das PCR-Produkt durch standardmäßige Ethanol-Fällung vorkonzentriert werden. Das Pellet kann dann in einem kleineren Volumen Acrylamid-Präpolymer aufgelöst werden. In unseren Händen wurde die erhöhte Konzentration in der Vertiefung durch Verluste während der Fällung ausgeglichen. In einigen Fällen (z. B. bei einer schwachen Produktbande) kann dieser Ansatz bevorzugt werden.

Die fluoreszierende Bande mit dem einzelsträngigen, fluoresceinmodifizierten Produkt wurde unter blauer LED-Beleuchtung bei ∼475 nm (Bulldog Bio, Portsmouth, NH) aus dem Gel geschnitten. Die DNA wurde nach der Standardmethode „crush and soak“ eluiert (15). Wenn die eluierte (wiedergewonnene) DNA für eine effiziente Ethanolfällung zu verdünnt war, konzentrierten wir sie durch Extraktion mit Butanol. Das Produkt wurde dann mit Ethanol ausgefällt und wie unten angegeben weiter analysiert.

PAGE-Analyse

Die mit Fluorescein markierten einzelsträngigen Produkte (durch denaturierende PAGE freigesetzte ssDNA) wurden mittels nativer PAGE auf ihre Reinheit hin untersucht. Wir haben das einzelsträngige Produkt in 10 μl resuspendiert und durch UV-Vis-Spektroskopie quantifiziert. Wir stellten gleiche molare Konzentrationen von Primer und Einzelstrangprodukt her und elektrophoretisierten diese Proben und eine grün fluoreszierende 25-bp-Leiter (Jena Bioscience, Jena, Deutschland) auf einem 15%igen nativen PAGE-Gel, das mit dem Storm-Scanner für das Fluorescein-Signal visualisiert wurde.

Quencher-Analyse

Um weiter nachzuweisen, dass das Produkt tatsächlich einzelsträngig war, testeten wir die Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids (Quench-Sonde) mit einer 3′-Quencher-Modifikation. Bei korrekter Hybridisierung positioniert die Quench-Sonde einen Iowa Black Quencher innerhalb weniger Nanometer der 5′-Fluorescein-Modifikation auf dem komplementären Strang. Dies führt zu einer starken Abnahme der Fluoreszenzintensität. Die Quench-Sonde hybridisiert nur mit ssDNA. Wenn das Produkt doppelsträngig ist, wird die Hybridisierung blockiert, und die Fluoreszenz bleibt unbeeinflusst. In PCR-Gefäßen wurden dreifache 10-μl-Proben von 100 nM fluorescein-modifizierten Produkten (PCR-Produkt, SSG-Produkt und Primer-Kontrolle) hergestellt. Diese wurden mit einem QuantiFluor-Fluorometer (Promega, Madison, WI) gemessen, um die anfänglichen Fluoreszenzwerte zu ermitteln. Anschließend wurden 1,1 Moläquivalente der Quench-Sonden-DNA zugegeben, geschüttelt, zentrifugiert und etwa 1 Minute lang inkubiert. Die Fluoreszenz wurde dann aufgezeichnet, um festzustellen, ob ein Quenching auftrat.

Vergleich von Einzelstrang-Erzeugungstechniken für die Aptamer-Produktion

Um die Wirksamkeit dieser Methode für die Erzeugung funktioneller Aptamere festzustellen, kauften wir eine Vorlage für die PCR-Amplifikation einer bekannten Aptamer-Sequenz, die Lysozym bindet. Wir amplifizierten diese Vorlage mit einem Fluorescein-modifizierten Primer und einem Acrydit-modifizierten Reverse Primer. Wir führten das SSG-Protokoll wie oben beschrieben durch. Wir konjugierten Lysozym an 5,8 μm Carboxylat-modifizierte Beads (Bangs Labs, Fishers, IN) nach dem Standard-EDC-Kopplungsprotokoll. Diese Kügelchen wurden mit dem SSG-Produkt, fluoreszierender randomisierter DNA (ohne Sequenzähnlichkeit mit dem Aptamer) und einem chemisch synthetisierten fluoreszierenden Aptamer derselben Sequenz inkubiert. Als Negativkontrolle inkubierten wir auch unbeschichtete Beads mit dem chemisch synthetisierten fluoreszierenden Aptamer. Die Inkubation dauerte 30 Minuten, und die Beads wurden anschließend dreimal gewaschen. Diese Partikel wurden mit einem FACScalibur (BD Bioscience San Jose, CA) durchflusszytometrisch untersucht. Die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten bei Anregung durch 488-nm-Licht wurde aufgezeichnet.

Einzelstranderzeugung und -reinigung (horizontale Gelelektrophorese)

Ein 7 M Harnstoff denaturierendes Polyacrylamidgel wurde horizontal gegossen, wie zuvor beschrieben (16). Kurz gesagt wurden 25 mL Präpolymerlösung (7 M Harnstoff, 6% Acrylamid/Bis-Acrylamid, SB-Puffer) mit 84 μl APS und 20 μl TEMED eingeleitet. Das Gelpräpolymer wurde in eine horizontale Form gegossen. Die Form wurde dann in einen Plastikbeutel gelegt, der mit Stickstoff gespült wurde. Das Gel durfte 30 Minuten lang polymerisieren. Fluorescein-markierte und Acrydit-markierte DNA wurden in 1 M Natriumphosphat bei pH 8,0 gemischt und durch Erhöhen der Temperatur auf 80 °C und langsames Abkühlen bei 0,1 °C pro Sekunde auf RT annealed. Die Mischung wurde langsam abgekühlt, um die intermolekulare Hybridisierung zwischen zwei Strängen zu fördern. Die Präpolymermischung (2,5 ml) wurde durch Zugabe von 8,4 μl APS und 2 μl TEMED eingeleitet. Nach dem Mischen wurden 20 μl dieser Lösung zu den 5 μl DNA-Lösung hinzugefügt. Diese wurde dann in eine trockene Vertiefung des Polyacrylamidgels überführt. Um Verzerrungen der elektrischen Feldlinien zu vermeiden, wurden die übrigen Vertiefungen mit nicht-DNA-haltigem Acrylamid gefüllt. Das beladene Gel wurde in einen Plastikbeutel gegeben und mit Stickstoff gespült. Das Gel wurde 10 Minuten lang bei 10 V/cm betrieben. Anschließend wurde es mit einem blauen LED-Transilluminator und einer Digitalkamera abgebildet. Um die ssDNA aus dem vernetzten Gel in der Vertiefung freizusetzen, wurden 25 ml SB-Puffer in der Mikrowelle zum Sieden erhitzt. Dieser heiße Puffer wurde dann über das Gel gegossen. Die Elektrophorese wurde bei 10 V/cm für 10 Minuten fortgesetzt. Das Gel wurde zum Vergleich erneut wie oben beschrieben abgebildet.

Die anfängliche Assoziation zwischen der Fluorescein- und Acrydit-markierten DNA wurde mit 1 M Natriumphosphatpuffer gefördert. Wenn die DNA nur durch die Hybridisierung zusammengehalten würde, wären 7 M Harnstoff und der Austausch des Puffers in 5 mM SB-Puffer während der Elektrophorese ausreichend, um die DNA in das Gel freizusetzen. Stattdessen war Hitze erforderlich. Dies zeigt, dass der mobile DNA-Strang eher mit dem Gel assoziiert oder verstrickt ist als mit seinem komplementären DNA-Strang.

Ergebnisse und Diskussion

Acrydit-modifizierte DNA ist bei der Elektrophorese unbeweglich

Von den beiden Strängen des dsDNA-PCR-Produkts ist der Acrydit-Strang im Co-Polymer gefangen, während der komplementäre Strang beweglich ist. Um dies zu demonstrieren, wurde die PCR mit einem Primer durchgeführt, der sowohl mit Acrydit als auch mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff (Cy5) modifiziert war. Der Rückwärtsprimer wurde mit Fluorescein modifiziert. Das PCR-Produkt wurde in ein denaturierendes PAGE-Gel (5%) polymerisiert. Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 zu sehen. Zu Beginn sind sowohl der grün fluoreszierende als auch der rot fluoreszierende Strang kolokalisiert (gelb gefärbtes Gel). Nach Anlegen der Spannung wandert nur das mit Fluorescein markierte Produkt (grün) in das Gel. Der mit Acrydit und Cy5 ko-markierte Strang (rot) ist im endgültigen Gelbild fixiert (Abbildung 1B). Außerdem ist der restliche Primer aus der PCR-Reaktion als zweite grüne Bande deutlich sichtbar. Nach der Elektrophorese kann das reine, einzelsträngige Produkt geschnitten und nach den üblichen Gelreinigungsprotokollen eluiert werden.

Verifizierung einzelsträngiger DNA

Wir isolierten einzelsträngige, fluoresceinmodifizierte DNA durch Schneiden und Eluieren der interessierenden Bande. Um zu zeigen, dass das mit dieser Methode gewonnene Produkt einzelsträngig ist, haben wir zwei verschiedene Methoden angewandt. Die erste Methode war die native Gelanalyse. Abbildung 2A zeigt ein Bild eines nativen Gels, das den Primer, das PCR-Produkt (dsDNA) und die mit dieser Methode gereinigte ssDNA enthält. Das native Gel zeigt eine klare Trennung zwischen der dsDNA und der ssDNA. Nach der SSG mit dem Acrydit-Primer (gefolgt vom Schneiden des Gels und Eluieren des Produkts) ist der Großteil der isolierten DNA einzelsträngig.

Wir bestätigten dieses Ergebnis mit einer Quencher-modifizierten Hybridisierungssonde (Abbildung 2B). Die Sonde wurde so konzipiert, dass ein Quencher in die Nähe des Fluorescein-Anteils auf dem ssDNA-Produkt gebracht wurde. Nach der Hybridisierung reduziert das Quencher-Molekül die Fluoreszenzintensität um ∼90 %. Da die Sonde nur mit ssDNA hybridisiert, zeigt dieses Experiment, dass das fluoresceinmodifizierte Produkt einzelsträngig war. Als Negativkontrolle haben wir auch das dsDNA-PCR-Produkt getestet. Das doppelsträngige PCR-Produkt war nicht in der Lage, mit der Quencher-Sonde zu hybridisieren; daher blieb seine Fluoreszenz praktisch unverändert.

Aptamere, die durch PCR synthetisiert und durch Co-Polymerisation und Elektrophorese gereinigt wurden

Hochreine ssDNA wird durch unsere SSG-Technik hergestellt. Wir reinigten ssDNA-Aptamer-Produkte aus der PCR mit zwei Methoden: (i) SSG durch Co-Polymerisation und Elektrophorese und (ii) eine Biotin-Avidin-Immobilisierungstechnik, die an anderer Stelle beschrieben ist (z. B. Polysciences Technical data sheet 753) (17,18). Einzelsträngige Aptamere wurden auch durch chemische Synthese hergestellt. Abbildung 3A zeigt ssDNA-Aptamere, die mit den drei verschiedenen Methoden hergestellt wurden. Spur 1 ist eine Markierungsleiter für den Größenvergleich. Spur 2 zeigt die gereinigte ssDNA, die durch PCR mit einem Acrydit-Primer erzeugt wurde, gefolgt von Co-Polymerisation mit Acrylamid, Elektrophorese und Gelreinigung. Es ist nur eine Bande in der für ssDNA korrekten Größe sichtbar. Spur 3 ist die durch PCR mit einem biotinylierten Primer erzeugte ssDNA, gefolgt von der Reinigung mit Avidin-beschichteten Magnetbeads. Spur 4 ist chemisch synthetisierte DNA mit der gleichen Sequenz. Gereinigte ssDNA-Aptamer aus SSG durch Co-Polymerisation und Elektrophorese zeigten eine hohe Reinheit der ssDNA.

Als nächstes wollten wir testen, ob dieses Verfahren funktionelle Aptamere erzeugt. Dazu erzeugten wir ein zuvor beschriebenes Aptamer gegen Lysozym mittels PCR mit modifizierten Primern. Das Anti-Lysozym-Aptamer „Klon 1“ wurde erstmals im Ellington-Labor hergestellt und ursprünglich als RNA-Aptamer ausgewählt (19); andere Gruppen haben berichtet, dass die DNA-Sequenz auch als Aptamer wirkt (20,21). Wir fanden heraus, dass sowohl die PCR als auch die chemische DNA-Synthese ein funktionsfähiges Aptamer ergibt. Aus diesen und anderen Experimenten schließen wir, dass es sich um einen der wenigen Ausnahmefälle handelt, in denen sowohl die RNA als auch die zugehörige DNA-Sequenz das Ziel binden. Dies ist ein merkwürdiges und zufälliges Ergebnis; die meisten Aptamere funktionieren nicht, wenn sie direkt in eine andere Chemie übersetzt werden. Diese Ergebnisse bestätigen die vielen Beispiele in der Literatur, die darauf hindeuten, dass das Anti-Lysozym-Aptamer von Klon 1 ein Sonderfall ist.

Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte auch, dass das SSG-gereinigte ssDNA-Aptamer funktionell ist. Abbildung 4B zeigt mit Lysozym beschichtete Beads, die mit zufälliger DNA, dem chemisch synthetisierten Aptamer gegen Lysozym oder unserem SSG-gereinigten Aptamer gegen Lysozym exponiert wurden. Sowohl die SSG-gereinigten als auch die chemisch synthetisierten Aptamere zeigten eine starke Bindung an die mit Lysozym beschichteten Perlen, während die Zufalls-DNA keine signifikante Bindung an die Lysozym-Perlen zeigte. Dies deutet darauf hin, dass diese Wechselwirkungen spezifisch für die Aptamer-Sequenz sind. Unbeschichtete Beads zeigen keine Fluoreszenz mit oder ohne Aptamer, was darauf hinweist, dass die Bindung spezifisch für das Protein ist.

Durch Erhitzen wird die DNA aus den Vertiefungen freigesetzt

Bei der Reinigung von ssDNA-Aptameren aus dem PCR-Produkt mit der SSG-Methode war es notwendig, das Gel zu erhitzen, um die DNA-Elektrophorese zu erleichtern (siehe „Materialien und Methoden“). Um zu verstehen, warum dies notwendig war, haben wir horizontale PAGE verwendet. Ohne Wärmezufuhr wurde das gewünschte ssDNA-PCR-Produkt trotz der Verwendung von 7 M Harnstoff und des Spannungsgradienten in der Vertiefung zurückgehalten.

Unsere erste Hypothese war, dass dieser Rückhalt auf die 80 bp Hybridisierung im PCR-Produkt zurückzuführen ist. Um diese Theorie zu testen, reduzierten wir die Komplementarität auf 23 bp, indem wir die mit Fluorescein markierte Aptamer-DNA von Clone 1 (in Abbildung 4 als F-Aptamer bezeichnet) an einen 23 Nukleotide langen, mit Acrydit modifizierten Primer (in Abbildung 4 als AC-Clone1-P2 bezeichnet) anlagerten und SSG durch Co-Polymerisation und Elektrophorese durchführten. Trotz der relativ kurzen Hybridisierung von 23 bp wurden erhebliche Mengen der Aptamer-DNA in der Vertiefung zurückgehalten (Abbildung 4A, untere Spur). Dies deutet darauf hin, dass unsere Hypothese falsch war, da die kürzere Hybridisierungsstrecke von 23 bp, die in 7 M Harnstoff leicht denaturiert werden sollte, die Freisetzung des gewünschten ssDNA-Strangs aus der Vertiefung nicht ermöglichte.

Als nächstes testeten wir die Hypothese, dass die Retention von der Länge abhängig ist. Hier haben wir ein 5′-Acrydit-modifiziertes 19-Nukleotid langes Oligonukleotid (in Abbildung 4 als AC-DNA bezeichnet) mit einem 19-Nukleotid langen, vollständig komplementären, Fluorescein-markierten Oligonukleotid (in Abbildung 4 als F-DNA* bezeichnet) verbunden. Trotz der ähnlichen Hybridisierungslänge konnte die kurze DNA in einem denaturierenden Gel ohne Anwendung von Hitze leicht von ihrem Komplement getrennt werden. Praktisch der gesamte fluoresceinmarkierte 19-Nukleotid-Mobilstrang gelangt in das Gel (Abbildung 4A, mittlere Spur). Um zu zeigen, dass das Acrydit-modifizierte 19-mer zurückgehalten wurde, wurde ein sowohl mit Fluorescein als auch mit Acrydit modifizierter Strang (in Abbildung 4 als AC-DNA-F bezeichnet) ebenfalls in die Vertiefung (obere Spur) copolymerisiert und erfolgreich zurückgehalten. (siehe „Materialien und Methoden“ und ergänzende Tabelle S1 für Sequenz- und Nomenklaturdetails)

Nach den ersten 20 Minuten der Elektrophorese (ohne Erhitzung) war klar, dass ein Großteil der Aptamer-DNA von Klon 1 nicht mobil war (trotz einer kurzen Hybridisierungslänge). Um die Aptamer-DNA aus dem Polyacrylamid zu lösen, musste das Gel erhitzt werden. Wir erhitzten den Laufpuffer in der Mikrowelle bis fast zum Sieden und gossen ihn dann über das Gel im Bereich der Vertiefungen. Die Elektrophorese wurde dann für weitere 20 Minuten fortgesetzt (Abbildung 4B, untere Spur), und die Aptamer-Bande wurde dann mobil. Diese neue Bande hatte die gleiche Mobilität wie die erste mobile Bande, was darauf hindeutet, dass es sich um dieselbe Aptamer-Spezies handelt. Ebenso handelte es sich um die gleiche DNA-Probe, die in Abbildung 3A nur eine einzige Bande aufwies. Dieses Experiment zeigt, dass das Gel erhitzt werden muss, um die gesamte lange ssDNA aus dem Polyacrylamid zu lösen. Der Verbleib der DNA in der Vertiefung ist nicht auf Hybridisierung, sondern wahrscheinlich auf Verschränkung in der Polyacrylamidmatrix zurückzuführen.

Horizontale PAGE für Einzelstranggenerierung und integrierte Elektroelution

Die Verwendung eines horizontalen Gels ermöglicht die Durchführung einer Elektroelution, anstatt die Produktbande zu schneiden und zu extrahieren. Die Verwendung eines zweiten Extraktionskamms für zusätzliche Vertiefungen für die Elektroelution und Extraktion bei horizontaler PAGE beschleunigte die SSG und die Elektroelution der DNA. Wir verwendeten die Software Inkscape, um einen separaten Kamm für die Elektroelution zu entwerfen, der tiefer und breiter als der Ladekamm war (siehe ergänzendes Material für die Vorlage, die zum Schneiden der Kämme verwendet wurde). Der Entwurf wurde mit einem CO2-Laserschneider in Acryl geschnitten (siehe Abbildung 5, A und B).

Typischerweise wird die PAGE mit einem vertikalen Gel zwischen Glasplatten durchgeführt. Um ein horizontales PAGE-Gel zu gießen, musste der Sauerstoff während der Polymerisation ausgeschlossen werden. Wir führten die Polymerisation in einem mit Stickstoff (oder Argon) gefüllten Beutel durch, um den Sauerstoff auszuschließen. Das Gel wurde mit den beiden Kämmen gegossen, und die Elektrophorese wurde nach den Standardverfahren der horizontalen Gelelektrophorese durchgeführt.

Abbildung 5C zeigt ein horizontales Gel für SSG durch Co-Polymerisation und Elektrophorese mit Elektroelution. Die Lanes 1-4 (von oben) enthalten einen Aptamer-Pool. Lane 5 wurde leer gelassen, um eine versehentliche Kreuzkontamination zu vermeiden; der Primer-Standard in Lane 6 war vorhanden, um die unerwünschte Bande zu unterscheiden. Der Pool wurde mit einem Acrydit-modifizierten Primer und einem Fluorescein-markierten Primer amplifiziert. Der Acrydit-modifizierte Strang wurde in der Vertiefung zurückgehalten. Das mit Fluorescein markierte Produkt ist unter blauer LED-Beleuchtung deutlich sichtbar. Wir ließen den Primer durch die Extraktionsvertiefungen laufen und auf der anderen Seite des Gels wieder austreten (siehe Abbildung 5D). Die Produktbanden konnten dann unter einem Blaulichttransilluminator in Echtzeit beobachtet werden, wie sie sich den Extraktionsvertiefungen näherten. Sobald die Produktbanden in die Vertiefungen eintraten, wurden sie mit einer Pipette abgesaugt. Der Prozess dauerte etwa 1 Stunde. Die Ausfällung und Rückgewinnung erfolgte dann gemäß den veröffentlichten Aptamer-Selektionsprotokollen. Auf diese Weise entfiel ein separater Schritt zur Strangtrennung oder eine Extraktion des Gels über Nacht.

Es gibt mehrere Methoden zur Isolierung von ssDNA aus dsDNA. Zu den Methoden zur Reinigung von ssDNA aus PCR-Produkten gehören: induzierte Mobilitätsverschiebung (22), Biotin-Avidin-Bead-Immobilisierung (18), selektiver Verdau mit einer DNase (23) und asymmetrische Zugabe von PCR-Primern (24). Diese Methoden unterscheiden sich in Bezug auf Kosten, Reinheit und Skalierbarkeit. Eine induzierte Mobilitätsverschiebung (22) in einem Primer kann zu Problemen bei der Amplifikation führen (z. B. können PEG-modifizierte Primer in der PCR weniger gut funktionieren), und ein enzymatischer Verdau mit einer DNase (23) oder ein chemischer Bruch eines Strangs hinterlässt Verunreinigungen (sowie einen weiteren Schritt im Gesamtprozess). Die asymmetrische Zugabe von PCR-Primern (24) hinterlässt eine erhebliche Menge an dsDNA im Produkt und ist sehr anfällig für Amplifikationsfehler. Die beliebteste Methode ist die Extraktion des unerwünschten, biotinylierten Strangs mit Hilfe von Avidin-beschichteten Mikrokügelchen (18). Diese Methode hat mehrere Tücken. Nicht umgesetzte Primer besetzen die Avidin-Stellen auf den Kügelchen, und die Biotin-Avidin-Wechselwirkung bricht bei der Schmelztemperatur von langer, doppelsträngiger DNA zusammen (25). Dies trägt zu erheblichen dsDNA-Verunreinigungen bei. Bead-basierte Methoden sind mit erheblichen Kosten verbunden: 1,80 $/nMol für Avidin-Beads plus 0,50 $/nMol für den Biotin-Primer. SSG durch Co-Polymerisation und Elektrophorese erfordert nur Acrydit-Primer, die 0,80 $ pro nMol kosten. Polyacrylamid ist sehr preiswert und skalierbar. Die elektrophoretische Mobilität ist eine zweite Dimension der Reinigung, die mit dieser Technik einhergeht. Sowohl der mit Acrydit modifizierte Strang als auch etwaige Primerreste werden in einem einzigen Schritt aus der PCR-Reaktion entfernt.

Wir haben gezeigt, dass SSG zur Reinigung eines funktionellen Aptamers verwendet werden kann. Die Technik könnte auch zur Aufreinigung eines ssDNA-Pools im Zuge der DNA-Aptamer-Selektion verwendet werden. Darüber hinaus kann SSG auch für die Erzeugung von ssDNA für Affinitätssonden oder Rückgrat für DNA-Origami verwendet werden (3). Es ist wichtig anzumerken, dass die PCR-Produktion von DNA im Vergleich zur chemischen Synthese eine viel höhere Sequenztreue aufweist, was für Anwendungen wie DNA-Berechnungen/DNA-Schaltkreise von entscheidender Bedeutung ist (26).