RNase A: Häufig gestellte Fragen | AG Scientific Blog

Einführung in die RNase

Ribonukleasen (RNasen) sind eine große Gruppe von hydrolytischen Enzymen, die Ribonukleinsäure (RNA)-Moleküle abbauen. Es handelt sich um Nukleasen, die den Abbau von RNA in kleinere Bestandteile katalysieren. Sie sind eine Superfamilie von Enzymen, die den Abbau von RNA katalysieren und auf den Ebenen der Transkription und Translation wirken.

3D-Konformation des Ribonuklease-A-Enzyms

Diese Enzyme sind in allen lebenden Zellen und biologischen Flüssigkeiten vorhanden, einschließlich Prokaryoten und Eukaryoten, und erfüllen viele wichtige Funktionen. RNasen sind allgegenwärtig und haben in einer ungeschützten Umgebung eine sehr kurze Lebensspanne. Zu den zytotoxischen Wirkungen gehört die RNA-Spaltung, die zur Hemmung der Proteinsynthese und zur Auslösung der Apoptose führt. Diese zytotoxischen Wirkungen können durch Aufbringen von RNase auf die äußere Oberfläche der Zelle erzeugt werden, aber es wurde festgestellt, dass die Zytotoxizität um das 1000-fache ansteigt, wenn das Enzym künstlich in das Zytosol eingebracht wird, was darauf hindeutet, dass die Internalisierung in die Zelle der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt für die Toxizität ist.

RNasen werden als Endoribonukleasen und Exoribonukleasen klassifiziert. Endoribonukleasen sind die Formen A, P, H, I, III, T1, T2, U2, V1, PhyM und V.

Exoribonukleasen umfassen die RNase-Formen PH, II, R, D und T sowie Polynukleotidphosphorylase (PNPase), Oligoribonuklease, Exoribonuklease I und Exoribonuklease II. Diese Enzyme spalten verschiedene RNA-Arten auf unterschiedliche Weise.

In jüngster Zeit haben sich Forscher mit RNasen als möglichen Wirkstoffen für die Krebsbehandlung befasst. Die Idee ist, ein Enzym zu finden, das Krebszellen selektiv schädigt, ohne die umgebenden normalen Zellen zu beeinträchtigen.

RNase A Produkte von AG Scientific, Inc.

Häufig gestellte Fragen über RNase A

Was ist RNase A?

Ribonuklease A ist ein von der Bauchspeicheldrüse abgesondertes Verdauungsenzym, das spezifisch RNA-Polymere (nicht aber DNA-Polymere) „verdaut“ oder hydrolysiert, indem es die Phosphodiesterbindungen spaltet, die die kovalenten Verbindungen zwischen benachbarten Ribonukleotidresten in diesen Molekülen bilden.

Wofür steht das „A“ in RNase A?

Das „A“ in seinem Namen bezieht sich nicht auf seine Substratspezifität, sondern auf die vorherrschende Form des Enzyms, die von der Rinderbauchspeicheldrüse produziert wird. RNase A ist unmodifiziert, während RNase B, RNase C und RNase D Mischungen von Glykoformen sind.

Da RNase A in großer Menge und hoher Reinheit verfügbar ist, war sie Gegenstand bahnbrechender Arbeiten in der Proteinchemie und Enzymologie. Darüber hinaus haben zytotoxische Varianten und Homologe des Enzyms ihre Nützlichkeit als Chemotherapeutika bewiesen.

Was ist die Geschichte dieses Enzyms?

Es wurde von Christian Anfinsen benutzt, um zu beweisen, dass die Sequenz von Aminosäuren die Struktur eines gefalteten Proteins bestimmt, und es wurde von Stanford Moore und William Stein benutzt, um zu zeigen, dass eine bestimmte Anordnung von Aminosäuren im katalytischen Zentrum von Enzymen verwendet wird.

Ribonuclease A war auch das erste Enzym, das von R. Bruce Merrifield synthetisiert wurde, was zeigt, dass biologische Moleküle einfach chemische Einheiten sind, die künstlich hergestellt werden können. Alle diese zentralen Konzepte, die mit Hilfe der Ribonuklease entdeckt wurden, wurden mit Nobelpreisen ausgezeichnet.

Wie ist die Struktur von RNase A?

RNase-Struktur

Die relativ kleine, 124 Aminosäuren umfassende Sequenz der RNase A, die eine Molekülmasse von 12.600 Da. hat, enthält vier His-Reste, wobei zwei der Reste His12 und His119 direkt als katalytische Reste dieses Enzyms beteiligt sind. Der Imidazolring von His12 hat einen anonym niedrigen pK-Wert (pK < 6,0), was darauf schließen lässt, dass er für die Katalyse deprotoniert sein muss. Umgekehrt hat der Imidazolring von His119 einen anonym hohen pK-Wert (pK > 6,0), was darauf hindeutet, dass er für die Katalyse protoniert sein muss.

Ist Ribonuclease A ein Protein?

RNase A ist ein kleines Protein, das reife Enzym hat nur 124 Aminosäurereste, an die kein Kohlenhydrat gebunden ist. Im Gegensatz zu anderen Enzymen enthält RNase A 19 der 20 Säuren, nur Tryptophan fehlt.

Wie ist der Wirkungsmechanismus?

His12 wirkt als allgemeine Base, die das 2′-OH-Proton des sessilen Ribonuklein-Zuckerrings akzeptiert. Dies fördert einen nukleophilen Angriff des 2′-O auf das positiver geladene Phosphoratom (P), wodurch ein 2′-,3′-zyklisches Ribonukleotidphosphat-Zwischenprodukt entsteht. Die Bildung dieses Zwischenprodukts wird durch das Imidazol von His119 erleichtert, das als allgemeine Säure wirkt und sein Proton an das Sauerstoffatom in der anfälligen P-O-R‘-Bindung abgibt.

Für den zweiten Schritt der Reaktion werden die allgemeinen Säure- und Basenaktivitäten der Seitenketten dieser beiden His-Reste umgekehrt. His12 wirkt als allgemeine Säure, indem es sein neu erworbenes Proton an das 2′-,3′-zyklische Ribonukleotidphosphat-Zwischenprodukt abgibt, während His119 als allgemeine Base wirkt, indem es ein Proton von Wasser annimmt, um den Hydroxylangriff auf das gleiche 2′-,3′-zyklische Zwischenprodukt zu fördern.

Was ist die Spaltstelle von RNase A?

RNase A hydrolysiert effizient RNA-Verunreinigungen in DNA-Präparaten, indem sie die Phosphodiesterbindung zwischen der 3′-Phosphatgruppe eines Pyrimidin-Nukleotids (C und U) und der 5′-Ribose des benachbarten Nukleotids 1, 2, 3 spaltet. Das dabei entstehende 2′-,3′-zyklische Phosphodiester-Zwischenprodukt wird dann weiter zu einer 3′-Monophosphatgruppe hydrolysiert. Rinderpankreas-RNase A ist ein sehr stabiles Protein aus 124 Aminosäuren mit der höchsten gemessenen Aktivität gegenüber einzelsträngiger RNA und einer zweifach schnelleren Spaltungsrate an Cytidinresten im Vergleich zu Uridylresten.

Was ist die Säure/Base-Katalysereaktion von RNase A?

RNase A nutzt ebenfalls die Säure/Base-Katalyse, um ihre Substrate chemisch zu verändern. Saure oder basische Reste des Enzyms übertragen Protonen auf oder von dem Reaktanten, um die entstehenden Ladungen im Übergangszustand zu stabilisieren. Durch die Übertragung von Protonen entstehen in der Regel bessere Abgangsgruppen, wodurch die Reaktion energetisch günstiger wird.

Histidin ist ein sehr häufiger Aminosäurerest, der an der Katalyse beteiligt ist, da Histidin einen pKa-Wert nahe der Neutralität hat (pKa=6); daher kann Histidin bei physiologischem pH-Wert sowohl Protonen aufnehmen als auch abgeben.

Wie stabil ist Ribonuclease A?

Ribonuclease A ist erstaunlich stabil. Bei einem Verfahren zur Reinigung von Ribonuklease A aus Rinderbauchspeicheldrüsen beispielsweise werden Extrakte mit Schwefelsäure behandelt und dann fast bis zum Siedepunkt erhitzt, und Ribonuklease A ist das einzige, das überlebt. Das ist nicht verwunderlich, da sie von der Bauchspeicheldrüse abgesondert wird und ihre Aufgabe in der unwirtlichen Umgebung des Verdauungstrakts erfüllen muss. Die Stabilität der Ribonuklease A ist zu einem großen Teil auf vier Disulfidbrücken zurückzuführen, die verschiedene Teile der Kette zusammenkleben.

Im Allgemeinen sollte das Produkt gemäß den Anweisungen des Verkäufers gelagert und gehandhabt werden, um die Stabilität zu erhalten.

Wie wird RNase A inaktiviert?

RNase A ist ein recht stabiles Enzym und enthält vier Disulfidbrücken, die in allen pankreatischen Ribonukleasen von Säugetieren auftreten. Wenn die Brücken reduktiv gebrochen werden, wird das Protein denaturiert und ist inaktiv. Bei der Reoxidation faltet sich das Protein wieder zusammen und die vollständige Aktivität wird wiederhergestellt. Es ist jedoch auch möglich, die Brücken nur teilweise zu reduzieren und die Enzymaktivität zu erhalten. Die Entfernung von 4 Peptiden am Carboxylterminus zerstört die Enzymaktivität.

Was hemmt RNase A?

Uridinvanadat ist ein starker kompetitiver Inhibitor von RNase A. Was es so stark macht, ist die Tatsache, dass seine Struktur einen Übergangszustand nachahmt, der bei der Reaktion eine Zwischenstufe darstellt.

Wie wird RNase A aus dem Stamm hergestellt?

RNase A wird in der Regel durch 10-minütiges Kochen des Stammes hergestellt, um die kontaminierende DNase-Aktivität zu beseitigen, ohne die RNase zu beeinträchtigen. Das Erhitzen auf 65°C beeinträchtigt die RNasen nicht.

Wie wird der vorbereitete Stamm von RNase A rekonstituiert?

RNase A kann in einer Konzentration von 1 bis 10 mg/ml in 10 mM Tris-HCl, pH 7 gelöst werden.5, 15 mM NaCl gelöst werden, 15 Minuten lang auf 100°C erhitzt werden, um kontaminierende DNasen zu inaktivieren, und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt und in Aliquots dosiert werden.

Wie hoch ist die Arbeitskonzentration dieses Enzyms?

Die empfohlene Arbeitskonzentration von RNase A beträgt je nach Anwendung 1 bis 100 µg/ml. Das Enzym ist unter einem breiten Spektrum von Reaktionsbedingungen aktiv. Bei niedrigen Salzkonzentrationen (0 bis 100 mM NaCl) spaltet RNase A einzel- und doppelsträngige RNA sowie den RNA-Strang in RNA-DNA-Hybriden.

Welche Lagertemperatur und Handhabungsmaßnahmen sind für dieses Produkt zu beachten?

In einem dicht verschlossenen Fläschchen bei -20 ºC lagern. Nach dem Öffnen über Kieselgel unter Vakuum dehydrieren, bevor es wieder bei -20 ºC gelagert wird. Seien Sie bei der Handhabung vorsichtig. Verwenden Sie dieses Präparat nicht, wenn Sie nicht umfassend geschult sind oder die damit verbundenen Gefahren nicht kennen.

Welche Anwendungen gibt es für RNase A?

RNasen spielen eine wichtige Rolle beim RNA-Abbau und -Umsatz in allen Organismen. Das Enzym Ribonuklease kann die RNA-Helix aufspalten, indem es einen Komplex mit einzelsträngiger RNA bildet.

RNase A ist eine Endoribonuklease mit Funktionen im RNA-Stoffwechsel und bei der Regulierung der Genexpression.

RNase A spielt eine wichtige Rolle bei Krankheiten wie Autoimmunerkrankungen, Niereninsuffizienz und Pankreaserkrankungen. In jüngster Zeit wurde auch eine Antitumoraktivität für eine RNase A mit zytotoxischen und zytostatischen Eigenschaften festgestellt. Die Mitglieder der RNase-A-Superfamilie werden häufig exprimiert und sind in Serum und Gewebe von Säugetieren vorhanden.

Das Enzym kann zur Hydrolyse von RNA aus Proteinproben verwendet werden. Es kann in RNase-Schutz-Assays, zur Entfernung unspezifisch gebundener RNA, bei der Analyse von RNA-Sequenzen, zur Hydrolyse von in Proteinproben enthaltener RNA und bei der DNA-Reinigung verwendet werden.

Wie sieht das Produkt aus?

Wird als weißes, chromatographisch gereinigtes, gefriergetrocknetes Pulver geliefert. Aussehen/Form des Produkts kann je nach Hersteller variieren.

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