Tandem-Massenspektrometrie

Die Fragmentierung von Ionen in der Gasphase ist für die Tandem-Massenspektrometrie unerlässlich und erfolgt zwischen den verschiedenen Stufen der Massenanalyse. Es gibt viele Methoden zur Fragmentierung der Ionen, die zu unterschiedlichen Arten der Fragmentierung und damit zu unterschiedlichen Informationen über die Struktur und Zusammensetzung des Moleküls führen können.

In-Source-FragmentierungBearbeiten

Oft ist der Ionisierungsprozess so heftig, dass die entstehenden Ionen über genügend innere Energie verfügen, um im Massenspektrometer zu fragmentieren. Wenn die Produkt-Ionen für eine gewisse Zeit in ihrem Nicht-Gleichgewichtszustand verbleiben, bevor sie sich selbst dissoziieren, wird dieser Prozess als metastabile Fragmentierung bezeichnet. Die Düsen-Skimmer-Fragmentierung bezieht sich auf die gezielte Induktion der In-Source-Fragmentierung durch Erhöhung des Düsen-Skimmer-Potenzials bei Geräten, die in der Regel auf Elektrospray basieren. Obwohl die In-Source-Fragmentierung eine Fragmentierungsanalyse ermöglicht, handelt es sich technisch gesehen nicht um eine Tandem-Massenspektrometrie, es sei denn, metastabile Ionen werden vor der Autodissoziation massenanalysiert oder selektiert und die resultierenden Fragmente werden in einem zweiten Schritt analysiert. Die In-Source-Fragmentierung kann anstelle der Tandem-Massenspektrometrie durch den Einsatz der Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA)-Technologie verwendet werden, die eine Fragmentierung erzeugt, die direkt mit den Tandem-Massenspektrometriedaten übereinstimmt. Die von EISA beobachteten Fragmente haben eine höhere Signalintensität als herkömmliche Fragmente, die in den Kollisionszellen von Tandem-Massenspektrometern Verluste erleiden. EISA ermöglicht die Erfassung von Fragmentierungsdaten auf MS1-Massenanalysatoren wie Flugzeit- und Einzelquadrupolgeräten. Die In-Source-Fragmentierung wird oft zusätzlich zur Tandem-Massenspektrometrie (mit Post-Source-Fragmentierung) verwendet, um zwei Fragmentierungsschritte in einem Pseudo-MS3-Experiment zu ermöglichen.

Kollisionsinduzierte DissoziationBearbeiten

Bei einem Tandem-Massenspektrometrie-Experiment wird meist die Post-Source-Fragmentierung verwendet. Den Ionen, die in der Regel bereits schwingungsangeregt sind, kann auch durch Kollisionen mit neutralen Atomen oder Molekülen, die Absorption von Strahlung oder die Übertragung oder den Einfang eines Elektrons durch ein mehrfach geladenes Ion Energie zugeführt werden. Bei der kollisionsinduzierten Dissoziation (CID), auch kollisionsaktivierte Dissoziation (CAD) genannt, stößt ein Ion mit einem neutralen Atom oder Molekül in der Gasphase zusammen und wird anschließend dissoziiert. Betrachten wir zum Beispiel

AB + + M ⟶ A + B + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}}

wo das Ion AB+ mit der neutralen Spezies M zusammenstößt und anschließend auseinanderbricht. Die Einzelheiten dieses Prozesses werden durch die Kollisionstheorie beschrieben. Aufgrund der unterschiedlichen Konfiguration der Instrumente sind zwei verschiedene Arten von CID möglich: (i) Strahlenfragmentierung (bei der die Vorläuferionen im Flug fragmentiert werden) und (ii) Ionenfallenfragmentierung (bei der die Vorläuferionen zunächst eingefangen und dann fragmentiert werden).

Eine dritte und neuere Art der CID-Fragmentierung ist die kollisionelle Dissoziation mit höherer Energie (HCD). HCD ist eine für Orbitrap-Massenspektrometer spezifische CID-Technik, bei der die Fragmentierung außerhalb der Ionenfalle stattfindet, nämlich in der HCD-Zelle (bei einigen Geräten „Ionenleitmultipol“ genannt). HCD ist eine fallenartige Fragmentierung, die nachweislich strahlartige Eigenschaften aufweist. Es gibt frei verfügbare, groß angelegte Datenbanken für die hochauflösende Tandem-Massenspektrometrie (z. B. METLIN mit 850 000 molekularen Standards mit jeweils experimentellen CID MS/MS-Daten), die in der Regel zur Erleichterung der Identifizierung kleiner Moleküle verwendet werden.

Elektroneneinfang- und -übertragungsmethodenBearbeiten

Die Energie, die freigesetzt wird, wenn ein Elektron auf ein mehrfach geladenes Ion übertragen oder von diesem eingefangen wird, kann eine Fragmentierung bewirken.

ElektroneneinfangdissoziationBearbeiten

Wenn ein Elektron zu einem mehrfach geladenen positiven Ion hinzugefügt wird, wird die Coulombenergie freigesetzt. Die Hinzufügung eines freien Elektrons wird als Elektroneneinfangdissoziation (ECD) bezeichnet und wird dargestellt durch

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragments {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}{\ce {->fragments}}

für ein mehrfach protoniertes Molekül M.

ElektronentransferdissoziationBearbeiten

Das Hinzufügen eines Elektrons durch eine Ionen-Ionen-Reaktion wird Elektronentransferdissoziation (ETD) genannt. Ähnlich wie bei der Elektroneneinfangdissoziation wird bei der ETD die Fragmentierung von Kationen (z. B. Peptiden oder Proteinen) durch die Übertragung von Elektronen auf diese bewirkt. Sie wurde von Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka und Jarrod Marto an der University of Virginia erfunden.

ETD verwendet keine freien Elektronen, sondern setzt dazu radikalische Anionen (z. B. Anthracen oder Azobenzol) ein:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ Fragmente {\displaystyle ^{n+}+{\ce {A^{-}->}}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{\ce {A->Fragmente}}

wobei A das Anion ist.

ETD spaltet willkürlich entlang des Peptidrückgrats (c- und z-Ionen), während Seitenketten und Modifikationen wie Phosphorylierung intakt bleiben. Die Technik funktioniert nur bei Ionen mit höherem Ladungszustand (z>2), aber im Vergleich zur kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) ist die ETD vorteilhaft für die Fragmentierung längerer Peptide oder sogar ganzer Proteine. Dies macht die Technik wichtig für die Top-down-Proteomik. Ähnlich wie ECD ist ETD für Peptide mit Modifikationen wie Phosphorylierung geeignet.

Elektronentransfer und Kollisionsdissoziation mit höherer Energie (EThcD) ist eine Kombination aus ETD und HCD, bei der der Peptidvorläufer zunächst einer Ionen/Ionen-Reaktion mit Fluoranthen-Anionen in einer linearen Ionenfalle unterzogen wird, wodurch c- und z-Ionen erzeugt werden. Im zweiten Schritt wird die HCD-Allionenfragmentierung auf alle ETD-abgeleiteten Ionen angewandt, um vor der endgültigen Analyse im Orbitrap-Analysator b- und y-Ionen zu erzeugen. Bei dieser Methode wird eine doppelte Fragmentierung eingesetzt, um ionen- und damit datenreiche MS/MS-Spektren für die Peptidsequenzierung und PTM-Lokalisierung zu erzeugen.

Negative ElektronentransferdissoziationBearbeiten

Die Fragmentierung kann auch mit einer deprotonierten Spezies erfolgen, bei der ein Elektron von der Spezies auf ein kationisches Reagenz in einer negativen Elektronentransferdissoziation (NETD) übertragen wird:

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ Fragmente {\displaystyle ^{n-}+{\ce {A+->}}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{\ce {A->fragments}}

Nach diesem Transferereignis macht das Anion mit Elektronenmangel eine interne Umlagerung durch und fragmentiert. NETD ist das Ion/Ion-Analogon der Elektronenablösungsdissoziation (EDD).

NETD ist mit der Fragmentierung von Peptiden und Proteinen entlang des Rückgrats an der Cα-C-Bindung kompatibel. Die resultierenden Fragmente sind in der Regel Produktionen vom a- und x-Typ.

Electron-detachment dissociationEdit

Electron-detachment dissociation (EDD) ist eine Methode zur Fragmentierung anionischer Spezies in der Massenspektrometrie. Sie dient als negativer Gegenmodus zur Elektroneneinfangdissoziation. Negativ geladene Ionen werden durch Bestrahlung mit Elektronen mittlerer kinetischer Energie aktiviert. Dadurch werden Elektronen aus dem ionischen Muttermolekül ausgestoßen, was zur Dissoziation durch Rekombination führt.

Charge-transfer dissociationEdit

Die Reaktion zwischen positiv geladenen Peptiden und kationischen Reagenzien, auch bekannt als Charge-transfer dissociation (CTD), wurde kürzlich als alternativer Hochenergie-Fragmentierungsweg für Peptide mit niedrigem Ladungszustand (1+ oder 2+) nachgewiesen. Der vorgeschlagene Mechanismus der CTD unter Verwendung von Heliumkationen als Reagenz ist:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ Fragmente {\displaystyle {\ce {{^{1}+}+He+->}}\left^{2}+}}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->Fragmente}}}

Ersten Berichten zufolge verursacht CTD die Spaltung der Cα-C-Bindung des Rückgrats von Peptiden und liefert Produktionen vom a- und x-Typ.

PhotodissoziationBearbeiten

Die für die Dissoziation erforderliche Energie kann durch Photonenabsorption hinzugefügt werden, was zu einer Photodissoziation des Ions führt und durch

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{\mathit {h\nu }}->{A}+B+}}}

wobei h ν {\displaystyle h\nu }

das von dem Ion absorbierte Photon darstellt. Ultraviolettlaser können verwendet werden, können aber zu einer übermäßigen Fragmentierung von Biomolekülen führen.

Infrarot-Mehrphotonen-DissoziationEdit

Infrarot-Photonen erwärmen die Ionen und führen zur Dissoziation, wenn genügend von ihnen absorbiert werden. Dieser Prozess wird als Infrarot-Mehrphotonen-Dissoziation (IRMPD) bezeichnet und wird häufig mit einem Kohlendioxidlaser und einem Ioneneinfang-Massenspektrometer wie einem FTMS durchgeführt.

Schwarzkörper-Infrarot-StrahlungsdissoziationEdit

Schwarzkörperstrahlung kann zur Photodissoziation in einer Technik verwendet werden, die als Schwarzkörper-Infrarot-Strahlungsdissoziation (BIRD) bekannt ist. Bei der BIRD-Methode wird die gesamte Vakuumkammer des Massenspektrometers erhitzt, um Infrarotlicht zu erzeugen. BIRD nutzt diese Strahlung, um die Ionen zu immer energischeren Schwingungen anzuregen, bis eine Bindung bricht und Fragmente entstehen. Dies ähnelt der Infrarot-Multiphotonen-Dissoziation, bei der ebenfalls Infrarotlicht verwendet wird, allerdings aus einer anderen Quelle. BIRD wird am häufigsten bei der Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometrie eingesetzt.

Oberflächeninduzierte DissoziationEdit

Bei der oberflächeninduzierten Dissoziation (SID) entsteht die Fragmentierung durch den Zusammenstoß eines Ions mit einer Oberfläche im Hochvakuum. Heute wird die SID zur Fragmentierung einer breiten Palette von Ionen verwendet. Vor einigen Jahren wurde die SID nur für einfach geladene Ionen mit geringerer Masse verwendet, da die Ionisierungsmethoden und die Technologien der Massenanalysatoren noch nicht ausgereift genug waren, um Ionen mit hohem m/z-Wert ordnungsgemäß zu bilden, zu übertragen oder zu charakterisieren. Im Laufe der Zeit waren selbstorganisierende Monoschichten (SAMs) aus CF3(CF2)10CH2CH2S auf Gold die am häufigsten verwendeten Kollisionsflächen für die SID in einem Tandem-Spektrometer. SAMs haben sich aufgrund ihrer charakteristischen großen effektiven Massen für die Kollision eingehender Ionen als die begehrtesten Kollisionsziele erwiesen. Außerdem bestehen diese Oberflächen aus starren Fluorkohlenstoffketten, die die Energie der Projektilionen nicht wesentlich dämpfen. Die Fluorkohlenstoffketten sind auch deshalb vorteilhaft, weil sie einer leichten Elektronenübertragung von der Metalloberfläche auf die eintreffenden Ionen widerstehen können. Die Fähigkeit der SID, Subkomplexe zu erzeugen, die stabil bleiben und wertvolle Informationen über die Konnektivität liefern, wird von keiner anderen Dissoziationsmethode übertroffen. Da die mit der SID erzeugten Komplexe stabil sind und die Ladungsverteilung auf dem Fragment beibehalten wird, entsteht ein einzigartiges Spektrum, in dem der Komplex um eine engere m/z-Verteilung zentriert ist. Die SID-Produkte und die Energie, bei der sie sich bilden, geben Aufschluss über die Stärke und Topologie des Komplexes. Die einzigartigen Dissoziationsmuster helfen bei der Entdeckung der quartären Struktur des Komplexes. Die symmetrische Ladungsverteilung und die Dissoziationsabhängigkeit sind einzigartig für die SID und unterscheiden die erzeugten Spektren von allen anderen Dissoziationsverfahren.

Die SID-Technik ist auch für die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) geeignet. Drei verschiedene Methoden für diese Technik umfassen die Analyse der Charakterisierung der Topologie, der Intersubunit-Konnektivität und des Grades der Entfaltung der Proteinstruktur. Die Analyse der Entfaltung von Proteinstrukturen ist die am häufigsten verwendete Anwendung der SID-Technik. Bei der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) wird die SID zur Dissoziation der quellenaktivierten Vorstufen von drei verschiedenen Arten von Proteinkomplexen verwendet: C-reaktives Protein (CRP), Transthyretin (TTR) und Concanavalin A (Con A). Mit dieser Methode wird der Entfaltungsgrad für jeden dieser Komplexe beobachtet. Für diese Beobachtung zeigt die SID die Strukturen der Vorläuferionen, die vor dem Zusammenstoß mit der Oberfläche existieren. IM-MS nutzt die SID als direktes Maß für die Konformation der Untereinheiten der einzelnen Proteine.

Fourier-Transformations-Ionenzyklotronresonanz (FTICR) kann Instrumenten, die Massenmessungen vornehmen, eine ultrahohe Auflösung und hohe Massengenauigkeit verleihen. Diese Eigenschaften machen FTICR-Massenspektrometer zu einem nützlichen Instrument für eine Vielzahl von Anwendungen, z. B. für verschiedene Dissoziationsexperimente wie die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID), die Elektronentransferdissoziation (ETD) und andere. Darüber hinaus wurde mit diesem Gerät die oberflächeninduzierte Dissoziation zur Untersuchung der grundlegenden Peptidfragmentierung eingeführt. Insbesondere wurde die SID für die Untersuchung der Energetik und der Kinetik der Gasphasenfragmentierung in einem ICR-Instrument eingesetzt. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Gasphasenfragmentierung von protonierten Peptiden, Peptidionen mit ungeraden Elektronen, nicht-kovalenten Ligand-Peptid-Komplexen und ligierten Metallclustern zu verstehen.