Abstract
Glycogen phosphorylase ist ein wichtiges Enzym für den Kohlenhydratstoffwechsel im Muskel. Es verwendet anorganisches Phosphat, um Glukose aus Glykogen zu entfernen, wobei Glukose-1-Phosphat entsteht, das für die Produktion von ATP verwendet werden kann. Inaktive Glykogenphosphorylase (Phosphorylase h) wird entweder durch die allosterische Bindung von 5′-AMP oder durch Phosphorylierung durch Phosphorylase-Kinase (PhK) aktiviert. Durch Phosphorylierung entsteht Phosphorylase a, die in Abwesenheit von AMP aktiv ist. PhK ist die einzige Kinase, die Phosphorylase b phosphorylieren kann, die ihrerseits das einzige Substrat für PhK ist. In dieser Dissertation wurde versucht, die Gründe für diese Spezifität und die Art und Weise, wie diese beiden Enzyme einander erkennen, zu ermitteln, indem ortsgebundene Mutanten der Glykogenphosphorylase untersucht wurden. Alle Mutanten wurden auf Veränderungen in ihrer Interaktion mit einer verkürzten Form der katalytischen Untereinheit der Phosphorylase-Kinase, gamma(1–300), untersucht. Drei Mutationen (R69K, R69E und E501A), die an Stellen vorgenommen wurden, die mit dem Aminoterminus von Phosphorylase b oder a interagieren, zeigten kaum einen Unterschied in der Phosphorylierung durch gamma(1–300) im Vergleich zu Phosphorylase b. Fünf Mutationen an drei Stellen im aminoterminalen Schwanz der Phosphorylase (K11A, K11E, I13G, R16A und R16E) führten jedoch zu einer Verringerung der katalytischen Effizienz von gamma(1–300) im Vergleich zur Phosphorylase b. R16E war das schlechteste Substrat für gamma(1–300) und führte zu einer 47-fachen Verringerung der katalytischen Effizienz. Der Amino-Terminus und insbesondere Arg 16 sind sehr wichtige Faktoren für die Erkennung der Phosphorylase durch gamma(1–300). Außerdem konnten I13G und R16A von der Proteinkinase A phosphoryliert werden, die die native Phosphorylase nicht erkennt; bei einigen Mutanten wurden auch veränderte Konformationszustände beobachtet. R16A und R16E wurden bei einer sehr niedrigen AMP-Konzentration aktiviert und kristallisierten bei niedriger Temperatur wie Phosphorylase a. Dies deutet darauf hin, dass ihre Strukturen auch ohne Phosphorylierung eher der Phosphorylase a als der Phosphorylase b ähneln. Zwei andere Mutanten hatten den gegenteiligen Effekt und verhielten sich nach der Phosphorylierung wie Phosphorylase b. R69E wurde durch die Phosphorylierung nur teilweise aktiviert, und I13G war nach der Phosphorylierung völlig inaktiv. I13G war die erste Beobachtung einer Phosphorylaseform, die nicht durch Phosphorylierung aktiviert werden konnte.