Schlüsselenzyme und KomponentenBearbeiten
Der Prozess der V(D)J-Rekombination wird durch die VDJ-Rekombinase vermittelt, die aus einer Vielzahl von Enzymen besteht. Die wichtigsten beteiligten Enzyme sind die rekombinationsaktivierenden Gene 1 und 2 (RAG), die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) und die Artemis-Nuklease, ein Mitglied des ubiquitären nicht-homologen Endverknüpfungswegs (NHEJ) für die DNA-Reparatur. Es ist bekannt, dass mehrere andere Enzyme an diesem Prozess beteiligt sind, darunter die DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK), das X-ray repair cross-complementing protein 4 (XRCC4), die DNA-Ligase IV, der non-homologous end-joining factor 1 (NHEJ1; auch bekannt als Cernunnos oder XRCC4-like factor ), das kürzlich entdeckte Paralog von XRCC4 und XLF (PAXX) sowie die DNA-Polymerasen λ und μ. Einige der beteiligten Enzyme sind spezifisch für Lymphozyten (z. B. RAG, TdT), während andere in anderen Zelltypen und sogar ubiquitär vorkommen (z. B. NHEJ-Komponenten).
Um die Spezifität der Rekombination aufrechtzuerhalten, erkennt und bindet die V(D)J-Rekombinase an Rekombinations-Signalsequenzen (RSS), die die variablen (V), die Diversitäts- (D) und die verbindenden (J) Gensegmente flankieren. RSSs bestehen aus drei Elementen: einem Heptamer aus sieben konservierten Nukleotiden, einer Spacer-Region von 12 oder 23 Basenpaaren Länge und einem Nonamer aus neun konservierten Nukleotiden. Während die meisten RSS in ihrer Sequenz variieren, lauten die Konsensus-Sequenzen des Heptamers und des Nonamers CACAGTG bzw. ACAAAAACC; und obwohl die Sequenz der Spacer-Region wenig konserviert ist, ist die Länge hoch konserviert. Die Länge der Spacer-Region entspricht etwa einer (12 Basenpaare) oder zwei Windungen (23 Basenpaare) der DNA-Helix. Nach der so genannten 12/23-Regel grenzen die zu rekombinierenden Gensegmente in der Regel an RSS unterschiedlicher Spacerlänge (d. h. eines hat eine „12RSS“ und eines eine „23RSS“). Dies ist ein wichtiges Merkmal bei der Regulierung der V(D)J-Rekombination.
ProcessEdit
Die V(D)J-Rekombination beginnt, wenn die V(D)J-Rekombinase (durch die Aktivität von RAG1) eine RSS bindet, die ein kodierendes Gensegment (V, D oder J) flankiert, und einen Einzelstrang-Nick in der DNA zwischen der ersten Base der RSS (kurz vor dem Heptamer) und dem kodierenden Segment erzeugt. Dies ist im Wesentlichen energetisch neutral (keine ATP-Hydrolyse erforderlich) und führt zur Bildung einer freien 3′-Hydroxylgruppe und einer 5′-Phosphatgruppe auf demselben Strang. Die reaktive Hydroxylgruppe wird von der Rekombinase so positioniert, dass sie die Phosphodiesterbindung des gegenüberliegenden Strangs angreift und zwei DNA-Enden bildet: eine Haarnadel (Stammschleife) auf dem kodierenden Segment und ein stumpfes Ende auf dem Signalsegment. Das derzeitige Modell geht davon aus, dass das DNA-Nicking und die Haarnadelbildung auf beiden Strängen gleichzeitig (oder fast gleichzeitig) in einem als Rekombinationszentrum bekannten Komplex stattfinden.
Die stumpfen Signalenden werden bündig miteinander ligiert, um ein kreisförmiges DNA-Stück zu bilden, das alle dazwischen liegenden Sequenzen zwischen den kodierenden Segmenten enthält und als Signalfuge bezeichnet wird (obwohl es kreisförmig ist, darf es nicht mit einem Plasmid verwechselt werden). Ursprünglich ging man davon aus, dass sie bei aufeinanderfolgenden Zellteilungen verloren gehen, doch gibt es Hinweise darauf, dass Signalfugen wieder in das Genom gelangen und durch die Aktivierung von Onkogenen oder die Unterbrechung der Funktion von Tumorsuppressorgenen zu Pathologien führen können.
Die kodierenden Enden werden vor ihrer Ligation durch mehrere Ereignisse weiterverarbeitet, die schließlich zur Fugenvielfalt führen. Die Verarbeitung beginnt, wenn DNA-PK an jedes gebrochene DNA-Ende bindet und mehrere andere Proteine rekrutiert, darunter Artemis, XRCC4, DNA-Ligase IV, Cernunnos und mehrere DNA-Polymerasen. Die DNA-PK bildet einen Komplex, der zu ihrer Autophosphorylierung führt, was die Aktivierung von Artemis zur Folge hat. Die kodierenden End-Hairpins werden durch die Aktivität von Artemis geöffnet. Wenn sie in der Mitte geöffnet werden, entsteht ein stumpfes DNA-Ende; in vielen Fällen ist die Öffnung jedoch „exzentrisch“ und führt dazu, dass zusätzliche Basen auf einem Strang verbleiben (ein Überhang). Diese werden als palindromische (P) Nukleotide bezeichnet, da die Sequenz palindromisch ist, wenn die DNA-Reparaturenzyme den Überhang auflösen. Der Prozess der Haarnadelöffnung durch Artemis ist ein entscheidender Schritt der V(D)J-Rekombination und ist im Mausmodell der schweren kombinierten Immunschwäche (Scid) defekt.
Als nächstes richten XRCC4, Cernunnos und DNA-PK die DNA-Enden aus und rekrutieren die terminale Deoxynucleotidyltransferase (TdT), eine schablonenunabhängige DNA-Polymerase, die nicht-templierte (N) Nucleotide an das kodierende Ende anfügt. Die Anfügung erfolgt größtenteils zufällig, aber TdT zeigt eine Vorliebe für G/C-Nukleotide. Wie alle bekannten DNA-Polymerasen fügt die TdT Nukleotide an einen Strang in 5′-3′-Richtung an.
Schließlich können Exonukleasen Basen von den kodierenden Enden entfernen (einschließlich aller P- oder N-Nukleotide, die sich möglicherweise gebildet haben). Die DNA-Polymerasen λ und μ fügen dann je nach Bedarf zusätzliche Nukleotide ein, um die beiden Enden für die Verbindung kompatibel zu machen. Da es sich hierbei um einen stochastischen Prozess handelt, kann jede beliebige Kombination aus dem Hinzufügen von P- und N-Nukleotiden und der exonukleolytischen Entfernung auftreten (oder auch gar keine). Schließlich werden die prozessierten kodierenden Enden durch die DNA-Ligase IV ligiert.
Alle diese Prozessierungsvorgänge führen zu einem Paratop, das sehr variabel ist, selbst wenn die gleichen Gensegmente rekombiniert werden. Die V(D)J-Rekombination ermöglicht die Bildung von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren für Antigene, denen weder der Organismus noch seine Vorfahren zuvor begegnet sein müssen, so dass eine adaptive Immunantwort auf neuartige oder häufig wechselnde Krankheitserreger (z. B. saisonale Grippe) möglich ist. Ein wesentlicher Nachteil dieses Prozesses ist jedoch, dass die DNA-Sequenz in-frame bleiben muss, damit die korrekte Aminosäuresequenz im endgültigen Proteinprodukt erhalten bleibt. Wenn die resultierende Sequenz außerhalb des Rahmens liegt, wird die Entwicklung der Zelle gestoppt, und die Zelle überlebt nicht bis zur Reife. Die V(D)J-Rekombination ist daher ein sehr kostspieliger Prozess, der streng reguliert und kontrolliert werden muss (und wird).