Verbesserung der Löslichkeit rekombinanter Proteine mit dem MBP-Tag

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E. coli-Expression

Die Herstellung rekombinanter Proteine erfordert die Verwendung eines Expressionswirts, und E. coli ist normalerweise die erste Wahl für diesen Zweck. Die Kombination aus einfacher Genetik, einfacher Kultivierung, schneller Expression und hohen Erträgen macht es zu einem attraktiven Wirt, während das Fehlen einer effizienten Posttranslationsmaschinerie, Codon Usage Bias und die Schwierigkeit, Proteine mit höherem Molekulargewicht herzustellen, es zu einem Nachteil machen. Eines der größten Übel bei der E.coli-Expression ist jedoch die unlösliche Expression – das Phänomen, bei dem die rekombinante Überexpression zur Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten, den sogenannten Einschlusskörpern, führt.

Möglichkeiten, mit Einschlusskörpern umzugehen und die Löslichkeit von Zielproteinen zu verbessern

Wenn sich Einschlusskörper bilden, versuchen Wissenschaftler in der Regel einen umständlichen Prozess, die so genannte In-vitro-Protein-Solubilisierung und -Rückfaltung, um lösliches Protein zu gewinnen, oder sie versuchen, die Expression auf Prozess- oder Molekularebene zu optimieren, um Probleme mit der Unlöslichkeit zu vermeiden.

Beispiele für die Optimierung auf Prozessebene umfassen Methoden, die kein Target-Engineering erfordern. Zum Beispiel die Optimierung der Expressionsbedingungen, die Anpassung der Wachstums- und Induktionsbedingungen, die Änderung von Medien, Puffern usw. Eine Alternative wäre es, einen molekularen Ansatz zu verfolgen und das Zielprotein zu manipulieren, indem unerwünschte Elemente in seiner Sequenz durch die Schaffung von Trunkierungen oder die Mutation bestimmter Aminosäuren eliminiert werden, um das Protein löslicher zu machen. Man könnte auch einen rationalen Ansatz der ortsgerichteten Mutagenese auf der Grundlage von Strukturinformationen wählen oder einen Ansatz der gerichteten Evolution verfolgen und die Löslichkeit von zufälligen Punktmutanten, Deletionen und Fragmenten untersuchen. Ein besserer und einfacherer Ansatz wäre eine Fusionspartnerstrategie, bei der ein vorgeschalteter Fusionspartner verwendet wird, der das Zielprotein löslicher macht.

Fusionspartneransatz zur Verbesserung der Löslichkeit von Proteinen

Bei diesem Ansatz wird ein schwer zu exprimierendes Protein oder Peptid mit einem anderen, stabilen, gut löslichen Protein fusioniert, um die Expression zu stabilisieren, mit der Vorstellung, dass das Fusionsprotein die resultierende Expression steuert. Obwohl viele Proteine gut löslich sind, sind sie nicht alle als Löslichkeitsverstärker für Proteine wirksam. In dieser Hinsicht kann das Maltose-bindende Protein ein sehr nützlicher Partner für die Löslichkeit von Proteinen sein. In einer vergleichenden Studie zur Untersuchung ihrer die Proteinlöslichkeit verbessernden Eigenschaften erwies sich der E. coli MBP-Tag als ein wesentlich effektiverer Proteinlöslichkeitspartner als die Proteine Glutathion-S-Transferase (GST) und Thioredoxin (TRx).

Abbildung 1: GenScript-Wissenschaftler-Empfehlung in Bezug auf Konstrukt-Design

Über den MBP-Tag und seinen Wirkungsmechanismus

MBP ist ein ungefähr 42 kDa, natürlich vorkommendes Protein in E. coli, kodiert durch das malE-Gen, das für die Aufnahme, Abbau und Transport von Maltodextrin, einem Kohlenhydrat, verantwortlich ist. Ursprünglich wurde es in den 1980er Jahren als Proteinexpressions-Tag entwickelt und ist dafür bekannt, dass es die Löslichkeit einer Reihe von nachgeschalteten Zielproteinen erheblich verbessert. Während der genaue Mechanismus der Verbesserung der Proteinlöslichkeit durch das MBP-Tag unklar ist, ist bekannt, dass es sein nachgeschaltetes Passagierprotein während und nach der Proteinsynthese stabilisiert und vor proteolytischem Abbau schützt. Die zytoplasmatische Ausbeute von MBP-fusionierten Proteinen ist in der Regel auch deshalb höher, weil das Fusionsprotein einen zuverlässigen Kontext für eine effiziente Translationsinitiierung bietet. Es wird auch vermutet, dass das MBP-Tag als Chaperon wirken könnte, indem es über einen Hot Spot auf seiner Oberfläche, der dem Lösungsmittel ausgesetzt ist, Wechselwirkungen herstellt, die das ansonsten unlösliche Passagierprotein stabilisieren.

Die Verwendung des MBP-Tags

Es hat sich zwar gezeigt, dass das MBP-Tag, das entweder an den N- oder den C-Terminus fusioniert ist, die rekombinante lösliche Expression erhöht, aber ein gängiger Ansatz ist die Fusion an den N-Terminus. Da leider kein Tag für alle Anwendungen ideal ist, wurden kombinatorische Tagging-Methoden für verschiedene Bedürfnisse entwickelt, um die Vielseitigkeit von Tags und nachgeschalteten Anwendungen zu erhöhen. Zwei Affinitäts-Tags, die im Tandem zusammen mit einer dem Zielprotein vorangestellten Proteaseschnittstelle exprimiert werden, ermöglichen den Einsatz mehrerer Reinigungsstrategien. Durch den Einbau eines löslichkeitsfördernden Tags in Kombination mit einem Aufreinigungs-Tag werden Verbesserungen der Proteinlöslichkeit und der Expressionsausbeute sowie Methoden für eine effiziente Aufreinigung erreicht

Abbildung 2: Ein allgemeines Schema für die Konstruktionsstrategie – eine Kombination aus Affinitäts-/Löslichkeits-Tag am N-Terminus, einer proteolytischen Spaltstelle gefolgt vom Zielprotein kann gute Ergebnisse liefern, insbesondere bei unlöslichen Zielproteinen. Eine Linker-Sequenz kann oft bei Problemen mit der proteolytischen Spaltung helfen.

Reinigung von MBP-gekennzeichneten Proteinen

Neben der Verbesserung der Proteinlöslichkeit besteht ein weiterer Vorteil einer MBP-Fusionsstrategie darin, dass die Reinigung des nachgeschalteten Zielproteins erleichtert wird. MBP ist ein natürlicher Affinitäts-Tag, der an Amylose-Harz bindet und für eine einstufige Affinitätsreinigung durch Bindung an vernetzte Amylose verwendet werden kann. Mit MBP-Tag fusionierte rekombinante Proteine, die an immobilisierte Amylose gebunden sind, werden in der Regel unter nicht denaturierenden Bedingungen mit Maltose eluiert.

Nachteile dieser Strategie

• Die Spaltung des Zielproteins kann aufgrund der sterischen Hinderung durch den MBP-Tag ein Problem darstellen
• Das Amyloseharz kann zerbrechlich und relativ teuer sein
• Die Ausfällung des Zielproteins nach der Spaltung
• Einige MBP-Fusionsproteine binden nicht effizient an das Amyloseharz, und selbst wenn sie es tun, kann die Ausbeute ein Problem sein

Abschluss

Es gibt zwar keine einfache, globale Lösung für die Unlöslichkeitsprobleme bei der E.coli-Expression gibt, kann man mit einem gut ausgearbeiteten Konstrukt und einer sorgfältig ausgearbeiteten Expressionsstrategie das gewünschte lösliche Protein erhalten. MBP ist ein zuverlässiger Löslichkeitsmarker für die rekombinante Produktion löslicher Proteine. Obwohl die Löslichkeit eines der wichtigsten Elemente einer Proteinproduktionskampagne ist, sollte das Endziel nicht immer die Löslichkeit sein. Expressionsniveau, Proteinaktivität, Reinheit, Homogenität und Stabilität sind allesamt wichtige Faktoren, die ebenfalls in Betracht gezogen werden müssen, bevor eine Kampagne zur Herstellung rekombinanter Proteine in Angriff genommen wird.

Einige Veröffentlichungen, die den Nutzen des MBP-Tags zeigen

Die Herstellung von Fusokinen mittels MBP-Maltose-Binding Protein Fusion Allows for High Level Bacterial Expression and Purification of Bioactive Mammalian Cytokine Derivatives (September 2014)

The rescue of aggregation-prone proteins using MBP -Rescuing aggregation-prone proteins in Escherichia coli with a dual His₆-MBP tag (May 2014)

MBP for soluble protein production in E. coli -Hexahistidin-markiertes Maltose-bindendes Protein als Fusionspartner für die Herstellung löslicher rekombinanter Proteine in Escherichia coli (2009)

1. Pryor, K. A., and Leiting, B. (1997). High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-tag and maltose binding protein double-affinity fusion system. Protein Expr. Purif. 10, 309-319
2. Routzahn, K. M. und Waugh, D. S. (2002). Differential effects of supplementary affinity tags on the solubility of MBP fusion proteins. J. Struct. Funct. Genomics 2, 83-92
3. Nallamsetty, S., Austin, B. P., Penrose, K., J., und Waugh, D. S. (2005) Gateway Vectors for the production of combinatorially tagged His6-MBP fusion proteins in the cytoplasm and periplasm of Escherichia coli. Protein Sci. 14, 2964-2971
4. Esposito D, Chatterjee DK: Verbesserung der Expression löslicher Proteine durch die Verwendung von Fusions-Tags. Curr Opin Biotechnol 2006, 17:353-8.184.
5. Peti W, Page R: Strategies to maximize heterologous protein expression in Escherichia coli with minimal cost. Protein Expr Purif 2007, 51:1-10.]
6. Wilkes D.M., Expression und Reinigung der ersten Nukleotid-bindenden Domäne und Linker-Region des menschlichen Multidrug-Resistenz-Genprodukts: Vergleich von Fusionen mit Glutathion-S-Transferase, Thioredoxin und Maltose-bindendem Protein. Biochemical Journal 1999, 77-81
7. Fox JD, Kapust RB, Waugh DS: Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci 2001, 10:622-630

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