In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkung einer akuten intravenösen Volumenbelastung mit 0.9%ige Kochsalzlösung, 3%ige Kochsalzlösung und isotonische Glukoseinfusionen auf u-AQP2 und u-ENaCγ in einer randomisierten Crossover-Studie an gesunden Probanden untersucht. Ziel war es, die Transportaktivität über die Aquaporin-2-Wasserkanäle und die epithelialen Natriumkanäle in den Hauptzellen im distalen Teil des Nephrons zu bewerten.
Während der Infusion und in der Zeit unmittelbar danach kommt es zu adaptiven physiologischen Veränderungen der Nierenfunktion und der vasoaktiven Hormone. Es ist daher zu erwarten, dass die wichtigsten Veränderungen der Effektgrößen nach der Infusion auftreten. In der vorliegenden Studie haben wir den Veränderungen der Effektvariablen in der letzten Phase nach der Infusion (Postinfusion 210-240), d. h. 60-90 Minuten nach Beendigung der Infusion, besondere Aufmerksamkeit geschenkt. In diesem Zeitraum stieg u-AQP2 nach hypertoner und isotoner Kochsalzinfusion an und sank nach Glukoseinfusion. Gleichzeitig stieg u-ENaCγ nach der Infusion mit hypertoner Kochsalzlösung an und blieb nach der Infusion mit isotoner Kochsalzlösung und Glukose unverändert.
U-AQP2 nach Infusion mit hypotoner und isotoner Kochsalzlösung und isotoner Glukose
Aquaporin-2 (AQP2) befindet sich in den Hauptzellen der Sammelkanäle und wird in der apikalen Plasmamembran exprimiert. Vasopressin (AVP) reguliert AQP2 durch Bindung an V2-Rezeptoren in der basolateralen Membran. Eine kurzzeitige Exposition gegenüber AVP bewirkt den Transport und die Einlagerung der intrazellulären Vesikel, die AQP2 enthalten, in die apikale Membran und erhöht die Wasserpermeabilität und -absorption. Die langfristige Regulierung erfolgt über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen und wird durch AVP-regulierte Gentranskription verursacht, die zu einem Anstieg der AQP2-Ganzzellhäufigkeit führt. Experimente an Ratten zeigten, dass die Infusion von dDAVP die u-AQP2-Konzentration erhöhte. Dies steht im Einklang mit der Ansicht, dass eine erhöhte Zufuhr von AQP2-Kanälen zur apikalen Membran zu einer erhöhten Ausscheidung von AQP2 nach Stimulation mit AVP führt. Etwa 3 % des AQP2 im Sammelkanal werden in den Urin ausgeschieden, aber die zugrundeliegenden Mechanismen sind unbekannt.
Die Volumenexpansion mit 3 %iger hypertoner Kochsalzlösung erhöht die Osmolarität des Plasmas über den Schwellenwert der hypothalamischen Osmorezeptoren hinaus, wodurch die Freisetzung von AVP und ein anschließender Anstieg von u-AQP2 ausgelöst wird. Saito et al. fanden eine signifikante Beziehung zwischen der Urinausscheidung von AQP2 und p-AVP bei gesunden Probanden nach Infusion von 5% hypertoner Kochsalzlösung. Pedersen et al. fanden eine positive Korrelation zwischen u-AQP2 und p-AVP während eines 24-stündigen Wasserentzugs und nach einer Infusion mit 3%iger hypertoner Kochsalzlösung. Somit haben frühere Studien am Menschen gezeigt, dass die Aktivität der AQP2-Wasserkanäle durch die Messung von u-AQP2 bestimmt werden kann. Überraschenderweise fanden Baumgartner et al. bei gesunden Probanden nach einer Infusion von 2,5% NaCl keine Veränderung des u-AQP2, obwohl sowohl die Osmolarität des Urins als auch das AVP deutlich anstiegen. Allerdings war die orale Wassermenge vor der Infusion 3-4 mal höher als in unserer Studie. Somit könnte die hohe Wassermenge vor der Infusion die stimulierende Wirkung der hypertonen Kochsalzlösung überlagert haben. Wie erwartet zeigte unsere Studie, dass u-AQP2 nach 3% NaCl mit einem entsprechenden Anstieg der Osmolarität des Urins und einer Verringerung von CH2O anstieg. Unsere Ergebnisse deuten also auf eine erhöhte Wasserrückresorption über die Aquaporin-2-Wasserkanäle in den distalen Tubuli hin. Vor dem Anstieg von u-AQP2 kam es zu einem abrupten Anstieg von p-osm und p-AVP, der durch die hypertone Kochsalzinfusion ausgelöst wurde. Tierstudien haben gezeigt, dass Hypertonie eine Steigerung der AQP2-Expression in der apikalen Membran bewirken kann, die mit der durch AVP allein erzielten vergleichbar ist. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass dies eine aktive Rolle bei der erhöhten Ausscheidung von u-AQP2 spielt. Höchstwahrscheinlich wurde die erhöhte Wasserrückresorption durch einen Anstieg von p-AVP vermittelt. U-AQP2 stieg während des gesamten Untersuchungstages weiter an, was darauf hindeutet, dass die AQP2-Kanäle in der apikalen Membran aufgrund der Wirkung von erhöhtem p-AVP eingefügt und aktiv blieben.
Die Infusion von isotonischer Kochsalzlösung senkt die fraktionierte Wasser- und Salzrückresorption in den proximalen Tubuli bei Tieren. In der vorliegenden Studie verursachte die Infusion von 0,9 % NaCl die gleiche Reaktion auf u-AQP2, u-osm und CH2O wie die Infusion von 3 % NaCl, wenn auch in geringerem Ausmaß. Es kam zu einem geringen Anstieg von p-osm bis zu einem Höchstwert von 286 mosmol/kg, was einem Anstieg von 0,5 % entspricht. Dieser Anstieg liegt unter dem Schwellenwert der Osmorezeptoren, und eine signifikante Veränderung des p-AVP wurde nicht beobachtet und auch nicht erwartet. Daher kann AVP nicht der Hauptregulator von AQP2 bei 0,9 % NaCl sein. Höchstwahrscheinlich ist der verstärkte Wassertransport über AQP2 ein kompensatorisches Phänomen, um einer Abnahme der renalen Wasserabsorption in den proximalen Tubuli entgegenzuwirken, die nach isotonischer Volumenexpansion auftritt. Der Mechanismus könnte auf eine erhöhte Aktivität des natriuretischen Peptidsystems zurückzuführen sein.
Die Infusion von 5 % Glukose bewirkt eine Volumenexpansion, die sich auf alle Flüssigkeitsphasen im Körper verteilt, wobei das Plasmavolumen nur sehr geringfügig zunimmt. Dies wird durch die Messungen des Plasmaalbumins veranschaulicht, dessen Konzentrationen nach 240 Minuten praktisch dem Ausgangswert entsprachen (Tabelle 4), was auf keine Veränderung der extrazellulären Flüssigkeit hinweist. Nach unserer Kenntnis wurde in keiner Studie das u-AQP2 nach einer Glukoseinfusion gemessen. In einer Studie mit gesunden Probanden wurde gezeigt, dass nach einer oralen Wasserzufuhr von 20 ml/kg über 15 Minuten (mittlere Aufnahme 1605 ml) das u-AQP2 nach 210 Minuten um 17 % abnahm. In einer neueren Studie erhielten die Probanden 15 Minuten lang eine orale Wassermenge von 20 ml/kg (mittlere Aufnahme 1389 ml), woraufhin der u-AQP2-Wert nach 240 Minuten um 27 % abnahm. Sowohl die Osmolarität des Plasmas als auch das p-AVP nahmen ab. Somit wurde gezeigt, dass u-AQP2 während der Wasserdiurese nach oraler Wasseraufnahme reduziert wird.
In unserer Studie erhielten die Probanden durchschnittlich 1736 ml Glukose intravenös. In der letzten Phase nach der Infusion trat die erwartete aquaretische Reaktion ein, mit einer 16%igen Abnahme von u-AQP2cr, einer Abnahme von u-osm und einer Zunahme von UO und CH2O. Die Plasmaosmolarität verringerte sich von 285 mosm/kg auf 280 m0sm/kg, d.h. um 2 %, jedoch ohne gleichzeitige Verringerung des p-AVP. Unsere Ergebnisse deuten auf eine verminderte Rückresorption von Wasser über die Aquaporin-2-Wasserkanäle in den distalen Tubuli nach isotonischer Glukoseinfusion hin. Die fehlende Veränderung des p-AVP könnte zum einen darauf zurückzuführen sein, dass die Probanden vor Beginn der Infusion eine orale Wassermenge von 1225 ml erhalten hatten, was das AVP in der Baseline-Periode zuvor unterdrückt haben könnte. Zweitens sind die Messungen der p-AVP-Konzentration möglicherweise nicht empfindlich genug, um eine geringe Abnahme zu erkennen. Das kürzlich entdeckte Peptid Apelin könnte ebenfalls eine Rolle spielen. Apelin ist mit AVP in magnozellulären Neuronen des Hypothalamus kolokalisiert. Bei gesunden männlichen Probanden führte eine Verringerung der Osmolarität des Plasmas durch Wasserzufuhr zu einer geringfügigen Verringerung von p-AVP, während p-Apelin rasch anstieg. Die Regulierung von Apelin ist der von AVP entgegengesetzt, und die Daten legen nahe, dass Apelin wie AVP an der Regulierung der Wasserhomöostase beteiligt sein könnte. Wir haben das p-Apelin nicht gemessen, aber es könnte von Interesse sein, das Plasma-Apelin parallel zum p-AVP unter den Bedingungen verschiedener Volumenexpansionen zu untersuchen.
So stieg das u-AQP2 in der letzten Periode nach der Infusion nach hypertonischer und isotonischer Kochsalzinfusion ungefähr in gleichem Maße an, während nach isotonischer Glukoseinfusion ein deutlicher Abfall zu beobachten war. Eine mögliche Erklärung für die Verzögerung der Veränderungen von u-AQP2 könnte darin bestehen, dass es nur wenige Minuten dauert, bis Veränderungen von AVP auf die Hauptzelle wirken, entweder durch Einlagerung oder Entfernung von AQP2 aus der apikalen Membran, aber es dauert mehrere Minuten, bevor die Wirkung in der Ausscheidung von u-AQP2 im Urin sichtbar wird.
U-ENaCγ nach Infusion mit hypotoner und isotoner Kochsalzlösung und isotoner Glukose
Der Natriumtransport durch den Sammelkanal erfolgt über den epithelialen Natriumkanal und ist für die Rückresorption von 3-5 % des gefilterten Natriums verantwortlich. ENaC besteht aus drei verschiedenen Untereinheiten: α, β und γ und ist an der apikalen Plasmamembran der Hauptzellen lokalisiert. ENaC ist ein Ziel von Aldosteron, das auf den Mineralocorticoidrezeptor wirkt. Aldosteron erhöht den Natriumtransport, indem es ENaC-Untereinheiten von intrazellulären Orten zur apikalen Membran umverteilt und auch die Gentranskription verändert. Während sich die Wirkung von Aldosteron über Stunden oder Tage erstreckt, ist an einem anderen synergistischen Weg AVP beteiligt. In den kortikalen Sammelkanälen von Ratten bindet AVP an die V2-Rezeptoren, stimuliert cAMP und erhöht die Natriumrückresorption, indem es den Transport und die Insertion von ENaC in die apikale Membran fördert und so eine schnelle Veränderung der Kanalaktivität bewirkt. Jüngste Studien am Menschen haben gezeigt, dass AVP über V2-Rezeptoren die ENaC-vermittelte Natriumrückresorption über die Hauptzellen stimuliert.
Fraktionen von ENaC werden normalerweise mit dem Urin ausgeschieden. Die Menge der ENaC-Fraktionen soll die Aktivität des Natriumtransports über die epithelialen Natriumkanäle widerspiegeln, so wie u-AQP2 den Funktionsstatus der AQP2-Wasserkanäle widerspiegelt. Vor kurzem hat unsere Gruppe eine neue Methode zur Bewertung der Natriumrückresorption in den Hauptzellen der distalen Tubuli eingeführt. Lauridsen et al. wiesen eine signifikante Korrelation zwischen Änderungen der Natriumausscheidung im Urin und Änderungen der Ausscheidung der Beta-Fraktion (u-ENaCβ) im Urin bei gesunden Menschen nach. Offenbar kann u-ENaCβ als Biomarker für den Transport von Natrium über ENaC verwendet werden. In der vorliegenden Studie haben wir die Gammafraktion des Proteins der epithelialen Natriumkanäle gemessen, um die Auf- und Abwärtsregulierung der γ-ENaC-Expression und des Natriumtransports über ENaC zu bewerten, wie zuvor von unserer Gruppe berichtet.
Der Natrium-Chlorid-Symporter (NCC) in den distalen Konvolut-Tubuli (DCT) ist ein weiterer wichtiger Natrium-Rückresorptionsweg. Die Natriumrückresorption in den DCT ist entscheidend für die Bestimmung der Natriummenge, die an die Hauptzellen im Sammelkanal abgegeben wird. Es ist allgemein anerkannt, dass die NCC durch Ang II und Aldosteron reguliert wird. Studien haben auch gezeigt, dass hohes AVP die Phosphorylierung von NCC erhöht und vermutlich zu einer größeren Natriumrückresorption führt.
Experimentelle Tierstudien haben gezeigt, dass isotonische und hypertonische Kochsalzlösung IV die Rückresorption von Natrium in den proximalen Tubuli verringert und dadurch die Natriummenge im Urin erhöht. Andersen LJ et al. untersuchten die Auswirkungen von hypertoner und isotoner Kochsalzlösung bei gesunden Probanden, die eine kontrollierte Diät erhielten. Die Probanden erhielten 90 Minuten lang entweder 25 ml/kg isotonische Kochsalzlösung oder 4,5 ml/kg 3%ige hypertonische Kochsalzlösung als Infusion. Die Natriumausscheidung im Urin nahm sowohl bei isotoner als auch bei hypertoner Kochsalzlösung zu, wobei die Natriurese nach hypertoner Kochsalzlösung diejenige nach isotoner Kochsalzlösung übertraf. Das Plasmanatrium und die Plasmaosmolarität stiegen nach hypertoner Kochsalzlösung erheblich an, ebenso wie das p-AVP. Unsere Studie zeigte, dass eine 3%ige NaCl-Infusion den u-ENaCγ, FENa, p-Osm, p-Na und p-AVP erhöhte. Somit spiegeln unsere Ergebnisse eine erhöhte Natriumrückresorption über ENaC in den Hauptzellen wider und bestätigen darüber hinaus die Ergebnisse von Andersen et al. Der Anstieg des u-ENaCγ könnte zum Teil durch einen erheblichen Rückgang der renalen Natriumabsorption proximal im Nephron erklärt werden, der durch einen Anstieg der Absorption im distalen Teil kompensiert und ausgeglichen wird. Der unmittelbar nach der 3%igen NaCl-Infusion beobachtete Anstieg des p-AVP könnte jedoch auch darauf hindeuten, dass der erhöhte u-ENaCγ durch die Wirkung von AVP verursacht wird. Eine erhöhte Natriumbewegung aus dem Lumen in die Zelle über ENaC würde theoretisch die Kaliumsekretion über die ROMK-Kanäle anregen. Überraschenderweise haben wir einen Rückgang der Kaliumausscheidung im Urin gemessen. Dies könnte gegen eine wichtige Rolle des ENaC-vermittelten Natriumtransports sprechen. Wenn NCC die Natriumrückresorption erhöht, sowohl um einen Rückgang der proximalen Rückresorption zu kompensieren als auch aufgrund eines hohen p-AVP, dann würde weniger Natrium durch ENaC transportiert werden und somit würde keine Kaliumausscheidung stattfinden. Eine mögliche Rolle des NCC nach Infusion mit hypertoner Kochsalzlösung ist rein spekulativ, da wir die Aktivität des NCC nicht gemessen haben. Möglicherweise haben wir den positiven Effekt auf die Kaliumsekretion innerhalb unserer Zeitgrenzen nicht gesehen. Der Kaliumtransport ist jedoch komplex, und es gibt viele Faktoren, die den Kaliumtransport modulieren, wie z. B. ein veränderter tubulärer Fluss und Aldosteron.
Nach der Volumenexpansion mit isotonischer Kochsalzlösung ist der onkotische Druck leicht reduziert, was zu einem sofortigen Anstieg der GFR und einer geringeren Rückresorption von Wasser im proximalen Tubulus führt. Wir haben einen geringen Anstieg der GFR und der UO-Ausscheidung gemessen. Die Natriumausscheidung nahm zu, aber u-ENaCγ, p-Na, p-osm und p-AVP blieben unverändert, so dass die Ergebnisse unseren Erwartungen entsprachen. Hinsichtlich der NCC würde man keine Veränderung der NCC-vermittelten Natriumrückresorption während der isotonischen Kochsalzlösung erwarten.
In keiner Studie wurde jemals der u-ENaCγ während der Wasserdiurese untersucht. In unserer Studie haben wir einen Trend zu einer Verringerung von u-ENaCγ nach Glukoseinfusion gemessen, was eine geringe Verringerung der Natriumrückresorption über ENaC in der Hauptzelle widerspiegelt. Wie bereits erwähnt, haben wir nach der Glukoseinfusion einen Rückgang der p-Osmolalität um 2 % gemessen, was theoretisch einen Rückgang des AVP auslösen sollte. Wir konnten keinen Rückgang des p-AVP feststellen, was vermutlich auf ein niedriges p-AVP zurückzuführen ist, das durch die orale Wasserzufuhr im Vorfeld verursacht wurde, oder auf die Tatsache, dass die Messungen der p-AVP-Konzentration möglicherweise nicht empfindlich genug sind, um kleine Veränderungen zu erkennen. Es könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass der Rückgang des u-ENaCγ auf eine fehlende AVP-Bindung an V2-Rezeptoren in der basolateralen Membran der Hauptzelle zurückzuführen sein könnte. Das Fehlen von AVP-Stimuli führt zu einer verstärkten Endozytose von ENaC-Kanälen von der Membranoberfläche in Recycling-Vesikel, wodurch die Rückresorption von Natrium vermindert wird.
So stieg u-ENaCγ in der letzten Phase nach der Infusion deutlich nach hypertoner Kochsalzlösung an, lag nach isotoner Kochsalzlösung ungefähr auf dem gleichen Niveau und nahm als Reaktion auf die Glukoseinfusion ab oder tendierte zu einer Abnahme. Der Anstieg von p-osm und p-AVP wurde unmittelbar nach Beendigung der 3%igen NaCl-Infusion beobachtet. Die Verzögerung und das konstante Niveau von u-ENaCγ nach hypertonischer Kochsalzlösung könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass es nur wenige Minuten dauert, bis die intrazellulären Depots der ENaC-Kanäle in die apikale Membran transportiert werden, aber mehrere Minuten, um ENaC nach der Stimulation mit AVP in den Urin auszuscheiden.
Vasoaktive Hormone
Neben dem AVP ist das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ein wichtiger Regulator der renalen Natriumausscheidung und damit des Flüssigkeitsvolumens des Körpers. Es ist bekannt, dass eine Natriumverarmung das RAAS aktiviert und eine chronische Natriumbelastung das RAAS reduziert. In vitro- und in vivo-Studien haben gezeigt, dass Aldosteron den Mineralocorticoidrezeptor zu einer erhöhten Transkription von Genen anregt, die für Proteine kodieren, die am Natriumtransport beteiligt sind, d.h. ENaC und Na,K-ATPase.
Zahlreiche Studien über Veränderungen des Blutvolumens haben gezeigt, dass akute Veränderungen mit inversen Anpassungen des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems verbunden sind. In der vorliegenden Studie führte die Volumenexpansion mit 3%iger und 0,9%iger Kochsalzlösung zu einer ähnlichen und signifikanten Verringerung von PRC, p-AngII und Aldo, was mit einer Zunahme des extrazellulären Volumens einhergeht. Dies stimmt mit früheren Studien überein.
Nach der Glukoseinfusion wurde keine signifikante Veränderung von PRC, p-AngII oder p-Aldo gemessen. Dies war zu erwarten, da die Glukoseinfusion keine deutliche Veränderung des extrazellulären Volumens bewirkt. Unsere Studie war nicht darauf ausgelegt, regulatorische Effekte von Aldosteron zu berücksichtigen, da die Wirkung von Aldosteron über Stunden oder Tage erfolgt. Daher müssen andere Faktoren an der Regulierung von ENaC beteiligt sein.
Stärken und Einschränkungen
Die größte Stärke dieser Studie war das Design als randomisierte Crossover-Studie mit einer homogenen Gruppe gesunder junger Männer und Frauen. Die Testbedingungen waren in Bezug auf Ernährung, Natrium- und Flüssigkeitszufuhr sehr gut definiert. Daher werden die Ergebnisse nicht durch einen unterschiedlichen Salz- oder Wasserhaushalt verfälscht. In dieser Studie wurden nur die akuten Auswirkungen der Volumenexpansion untersucht. Zweifellos hätten wir weitere Informationen über die langfristigen Auswirkungen der Volumenexpansion und die Urinausscheidung von AQP2 und ENaCγ gewinnen können, wenn der Zeitraum nach der Infusion länger gewesen wäre. Darüber hinaus war die Studie nicht placebokontrolliert, d. h. es wurde eine vernachlässigbare Menge 0,9 %iger Kochsalzlösung infundiert. Dadurch hätten die Auswirkungen der Volumenexpansion von der allgemeinen Variabilität der Wasser- und Salzrückresorption unterschieden werden können. In dieser Studie war es nicht möglich, ANP-Messungen durchzuführen. Dies hätte einen positiven Beitrag zu unseren Ergebnissen leisten können.