Wirkung eines oral verabreichten Atractylodes macrocephala Koidz-Wasserextrakts auf die Entzündungsreaktion von Makrophagen und T-Zellen bei Mäusen

Abstract

Das Rhizom von Atractylodes macrocephala Koidz (AM) ist ein Bestandteil verschiedener Qi-Booster-Mittel-Rezepte. Wir haben die Entzündungsreaktionen in Makrophagen und T-Zellen untersucht, die nach oraler Verabreichung von AM-Wasserextrakt (AME) aus Mäusen isoliert wurden. Peritoneale Exsudatzellen wurden aus Mäusen isoliert, denen Thioglykollat injiziert worden war, und Veränderungen der Scavenger-Rezeptoren wurden untersucht. Peritoneale Makrophagen wurden mit Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Die Zytokinreaktionen im Serum auf die intraperitoneale LPS-Injektion wurden ebenfalls untersucht. Die Splenozyten wurden isoliert und ihre Zusammensetzung und funktionelle Reaktion gemessen. Der Gehalt an Atractylenolid I und Atractylenolid III, bekannten entzündungshemmenden Inhaltsstoffen, in AME betrug 0,0338 mg/g Extrakt bzw. 0,565 mg/g Extrakt. AME erhöhte die Anzahl der SRA(+)CD11b(+)-Zellen als Reaktion auf Thioglykollat. Aus der AME-Gruppe isolierte peritoneale Makrophagen zeigten keine Veränderungen bei Entzündungsmarkern wie Tumornekrosefaktor- (TNF-) α, Interleukin- (IL-) 6, induzierbarer Stickoxidsynthase und Cyclooxygenase-2, wiesen aber einen Rückgang der CD86-Expression auf. Interessanterweise verringerte AME die Serumspiegel von TNF-α und IL-6 nach intraperitonealer Injektion von LPS. Was das adaptive Immunsystem betrifft, so erhöhte AME die CD4(+)-T-Zellpopulation und die Expression von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II in der Milz, und kultivierte Splenozyten aus der AME-Gruppe zeigten während der T-Zell-Aktivierung eine erhöhte Produktion von IL-4 bei gleichzeitig verringerter Interferon-γ-Produktion. AME förderte die Wiederauffüllung der peritonealen Makrophagen während der Entzündungsreaktion, aber seine entzündungshemmende Wirkung schien nicht durch die Modulation der Makrophagenaktivität vermittelt zu werden. AME veränderte auch den Immunstatus der CD4-T-Zellen und förderte die Th2-Reaktion.

1. Einleitung

Eine Entzündung ist eine Schutzreaktion zur Beseitigung schädlicher Reize, und Immunzellen sind die Hauptakteure in diesem Prozess. Je nach der Art der Antigenerkennung und der Fähigkeit, eine Gedächtnisreaktion zu erzeugen, werden die Immunzellen in das angeborene und das adaptive Immunsystem unterteilt. Angeborene Immunzellen wie Makrophagen und dendritische Zellen reagieren sofort auf Antigene mit begrenzter Rezeptorspezifität. Adaptive Immunzellen, bestehend aus T-Zellen und B-Zellen, sind antigenspezifisch, reagieren auf Antigene, die in das periphere lymphatische Gewebe eingedrungen sind, und erzeugen eine Gedächtnisreaktion. Die angeborenen Immunzellen sind die Hauptakteure in den frühen Stadien der Entzündung, aber mit der Zeit übernehmen die adaptiven Immunzellen die Führung.

Gewebeansässige Makrophagen spielen eine Schlüsselrolle für die Immunität und die Integrität des Gewebes. Die meisten Gewebemakrophagen stammen von embryonalen Vorläuferzellen ab. Unter stationären Bedingungen werden ihre Populationen durch ihre Langlebigkeit und durch lokale Proliferation aufrechterhalten, und einige Makrophagen werden durch aus Blutmonozyten stammende Zellen ergänzt. Während einer Entzündung werden aus dem Knochenmark stammende Monozyten an den Ort des Geschehens gebracht und differenzieren sich zu Makrophagen. Makrophagen beseitigen Krankheitserreger und Antigene durch Phagozytose und lösen Entzündungsreaktionen aus, indem sie Zytokine und Enzyme wie Tumornekrosefaktor- (TNF-) α, Interleukin- (IL-) 6, induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und Cyclooxygenase- (COX-) 2 produzieren. Darüber hinaus sind Makrophagen eine Art professioneller antigenpräsentierender Zellen (APCs), die T-Zellen Antigene präsentieren.

T-Zellen, die hauptsächlich aus CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen bestehen, werden aktiviert, wenn T-Zell-Rezeptoren (TCRs) mit antigenen Peptiden in Kontakt kommen, die von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf APCs gebunden sind. CD4-T-Zellen, die mehr als zwei Drittel der T-Zellen ausmachen, können in verschiedene Effektor-T-Helferzellen (Th-Zellen) wie Th1, Th2, Th17, T-Follikel-Helferzellen und regulatorische T-Zellen differenziert werden. Unter diesen Untergruppen wurden Th1- und Th2-Zellen als erste Typen definiert. Th1-Zellen sezernieren hohe Mengen an Interferon- (IFN-) γ und sind durch die Aktivierung von Makrophagen wirksam bei der Abwehr von intrazellulären Krankheitserregern, während Th2-Zellen Interleukin- (IL-) 4, IL-5 und IL-13 sezernieren und den Wirt durch die Rekrutierung von Eosinophilen und Mastzellen vor Helmintheninfektionen schützen. Obwohl diese T-Helferzellen für die Wirtsabwehr wichtig sind, kann die chronische Aktivierung eines beliebigen Th-Zelltyps zu immunvermittelten Störungen führen. Th1-Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei organspezifischer Autoimmunität und chronischen entzündlichen Erkrankungen, während Th2-Zellen für allergische Entzündungen verantwortlich sind.

Das Rhizom von Atractylodes macrocephala Koidz (AM), das zu den Korbblütlern gehört, wurde zur Behandlung von Funktionsstörungen des Verdauungssystems wie Appetitlosigkeit, Blähungen und Durchfall eingesetzt. Nach der traditionellen chinesischen Medizin stärkt AM das Qi, indem es anormale Flüssigkeitsansammlungen im Magen-Darm-Trakt auflöst. AM ist Bestandteil verschiedener Qi-stärkender Rezepturen. In der traditionellen chinesischen Medizin ist eine der wesentlichen Funktionen des Qi die Verteidigung. Aus diesem Grund geht man davon aus, dass Qi stärkende Kräuter das Immunsystem stärken. Da Qi stärkende Kräuter präventiv eingenommen werden, um den Immunstatus von Personen ohne offensichtliche Defekte zu verbessern, muss untersucht werden, wie sich das Immunsystem bei normalen Personen nach der Verabreichung von AM verändern kann. Trotz seiner häufigen Verwendung gibt es nur wenige Studien, die die Auswirkungen von AM auf das Immunsystem untersuchen.

AM enthält mehrere bioaktive Sesquiterpenoide wie Atractylenolid I, Atractylenolid II und Atractylenolid III sowie Polyacetylene. Die In-vitro-Behandlung von Makrophagen mit Atractylenolid I, Atractylenolid III und einigen Polyacetylenen hemmte die durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierte TNF-α- und iNOS-Expression. Die orale Verabreichung dieser fettlöslichen Komponenten zeigte bei Mäusen eine entzündungshemmende Wirkung. Bei den meisten traditionellen pflanzlichen Zubereitungen handelt es sich jedoch um Abkochungen auf Wasserbasis, was zu einer geringen Ausbeute an pharmakologisch aktiven fettlöslichen Komponenten führt. Außerdem können Polyacetylene in kochendem Wasser leicht zerstört werden. Daher wollten wir herausfinden, ob Makrophagen, die aus Mäusen isoliert wurden, die in kochendem Wasser extrahierte AM (AME) erhielten, entzündungshemmend reagieren. Wir untersuchten auch die Wirkung von AME auf die Entzündungsreaktion im Serum. Schließlich untersuchten wir die Zusammensetzung und die funktionelle Reaktion der Splenozyten auf eine Veränderung des adaptiven Immunsystems nach AME-Gabe.

2. Materialien und Methoden

2.1. Vorbereitung der Probe

Der aus Eusung (Südkorea) stammende AME wurde von E-Pulip Co., Ltd. (Lot. EPL1356-4) (Seoul, Südkorea) erworben. Ein Belegexemplar (# 2013-AM) wurde im Labor für Pflanzenimmunologie der Kyung Hee Universität hinterlegt. Kurz gesagt: 100 g der Probe wurden gemahlen, mit 1 l deionisiertem Wasser (DW) in einem Rückflussapparat und Heizmantel für 2 h bei 95 °C extrahiert und durch Whatman-Filterpapier Nr. 2 (Whatman International, Kent, England) filtriert. Der Extrakt wurde mit einem Rotationsverdampfer konzentriert und unter Vakuum gefriergetrocknet. Die Ausbeute an AME betrug 37,7 %. Für die Analyse mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurden 0,4 g AME in 10 ml Wasser gelöst und 5 Minuten lang bei 25 °C beschallt. Der Extrakt wurde in Ethylacetat gegeben, geschüttelt und 1 Minute lang stehen gelassen. Die obere Schicht Ethylacetat wurde überführt und dieser Vorgang dreimal wiederholt. Die letzte Ethylacetatschicht wurde konzentriert und gefriergetrocknet.

2.2. HPLC

Die Proben wurden mit einem Umkehrphasen-HPLC-System (Shimadzu 20A, Kyoto, Japan) analysiert, das aus einem Autosampler (SIL-20A), einer binären Pumpe (LC-20AD) und einem Photodiodenarray-Detektor (SPD-20A) bestand und mit einer YMC-Triart C18-Säule (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japan) ausgestattet war. Die Gradientenflüsse für das Zweilösungsmittelsystem (Lösungsmittel A, 0,05 % Phosphorsäure in Wasser; Lösungsmittel B, Acetonitril) waren wie folgt: 85% A/15% B bei 0 min, 85% A/15% B bei 5 min, 50% A/50% B bei 15 min, 50% A/50% B bei 20 min, 40% A/60% B bei 25 min, 40% A/60% B bei 30 min, 15% A/85% bei 35 min, 15% A/85% bei 40 min, 85% A/15% bei 42 min und 85% A/15% bei 45 min. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1,0 ml/min bei einem Injektionsvolumen von 10 μl. Die Detektion erfolgte bei 220 nm für Atractylenolid III (Sigma, St. Louis, MO, USA) oder bei 280 nm für Atractylenolid I (Sigma).

2.3. Tiere

Sieben Wochen alte männliche Balb/c-Mäuse wurden von SamTaco (Osan, Südkorea) bezogen und in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten, pathogenfreien Tieranlage mit einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Alle Tiere wurden vor den Experimenten 1 Woche lang angepasst. Die Dosen wurden anhand einer Berechnung ermittelt, die auf dem Unterschied zwischen der Körperoberfläche von Mäusen und Menschen beruht. Die empfohlene Dosis von AM für einen 60 kg schweren erwachsenen Menschen beträgt 8-24 g der Rohpflanze pro Tag oder 3-9 g des Extrakts pro Tag (basierend auf der Extraktionsausbeute in dieser Studie). Die Dosis für die Maus kann wie folgt bestimmt werden: eine menschliche Äquivalentdosis von 50-150 mg/kg × 12,3 (der Umrechnungskoeffizient) = eine Mausdosis von 615-1.845 mg/kg. Auf der Grundlage dieses Dosisbereichs wählten wir für diese Studie Dosen von 500 mg/kg und 2.500 mg/kg. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip den Versuchsgruppen zugewiesen. AME wurde 10 Tage lang einmal täglich über eine Schlundsonde verabreicht. Während des Versuchszeitraums gab es keine Unterschiede im Körpergewicht zwischen den Gruppen. Das Tierprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Kyung Hee University (KHUASP(SE)-15-012) genehmigt, und die Mäuse wurden gemäß den Spezifikationen des US National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (1996) behandelt.

2.4. Makrophagenpräparation

Für die Makrophagenisolierung wurden den Mäusen 4 Tage vor der Tötung 2 ml 3,5% steriles Thioglykollat (BD, Sparks, MD, USA) intraperitoneal injiziert. Am Ende des Versuchs wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet, und die Zellen des Peritonealexsudats wurden aseptisch durch Peritoneallavage mit kaltem DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA), das 10 % fötales Rinderserum (FBS; Hyclone) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt, isoliert. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen resuspendiert und mit einem TC20 Cell Counter (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) gezählt.

2.5. Vorbereitung der Milzzellen

Für die Isolierung der Milzzellen wurde die Milz am Ende des Experiments aseptisch entnommen. Nach dem Aufbrechen der Milz zwischen Glasobjektträgern in RPMI 1640 (Hyclone) mit 1% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin wurden die Zellen durch ein 70-μm-Zellsieb filtriert. Nach der Zentrifugation wurden die roten Blutkörperchen mit BD PharmLyse-Lysierpuffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) lysiert. Die Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin resuspendiert und mit einem T20 Cell Counter gezählt.

2.6. Intraperitoneale Injektion von LPS

Mäusen wurden am Ende des Experiments 1,3 mg/kg LPS (Serotyp 055:B5, Sigma) intraperitoneal injiziert. Nach 1 Stunde wurden die Mäuse mit Äther betäubt, und das Blut wurde durch Herzpunktion entnommen. Das Serum wurde gewonnen und bis zur Analyse bei -20°C gelagert.

2.7. Zellkultur

Peritoneale Exsudatzellen wurden in 6-Well-Platten oder 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Entfernung der nicht haftenden Zellen wurden die anhaftenden Zellen 24 Stunden lang mit 100 ng/ml LPS stimuliert. Splenozyten wurden in 24-Well-Platten plattiert und 48 Stunden lang mit 2 μg/ml Anti-CD3-Antikörper (BD Biosciences) stimuliert. Der Überstand wurde für die Zytokinanalyse gesammelt.

2.8. Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 1 × 106 Zellen/ml in FACS-Puffer (PBS/0,1% NaN3/1% FBS) resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem Ratten-Antimaus-CD16/CD32-Antikörper (BD Biosciences) 5 Minuten lang bei 4 °C blockiert und anschließend mit Fluorescein-konjugiertem Anti-Maus-SR-AI, PE-konjugiertem Anti-Maus-LOX1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PE-konjugiertem Anti-Maus-CD36 gefärbt, FITC-konjugiertes CD11b, PE-konjugiertes Anti-CD11b, PE-konjugiertes Anti-Maus-CD86, FITC-konjugiertes Anti-Maus-CD4, PE-konjugiertes Anti-Maus-CD8a, FITC-konjugiertes Anti-Maus-CD19 und FITC-konjugiertes Anti-Maus-IA/IE (BD Biosciences) (alle Antikörper wurden 1:100) für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln. Um unspezifische Bindungen aufzuzeigen, wurden passende Isotyp-Antikörper verwendet. Die Zellen wurden gewaschen und in FACS-Puffer resuspendiert. Insgesamt wurden 10.000 Ereignisse auf einem Navios-Durchflusszytometer (Beckman Coulter, La Brea, CA, USA) erfasst, und die Daten wurden mit der Kaluza-Software (Beckman Coulter) verarbeitet.

2.9. Zytokin-Analyse

Die Konzentrationen von TNF-α, IL-6, IFN-γ und IL-4 in Überständen und Seren wurden mit BD OptEIA-Maus-ELISA-Sets (BD Biosciences) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt.

2.10. Proliferationsassay

Splenozyten (4 × 105) in 96-Well-Platten wurden 48 Stunden lang mit löslichem Anti-CD3-mAb (2 μg/ml) stimuliert. Die Zellproliferation wurde mit dem CellTiter96 One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA) bestimmt.

2.11. RNA-Isolierung und Real-Time PCR

Die Gesamt-RNA wurde mit dem FavorPrep Total RNA Purification Kit (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan) isoliert, und die cDNA wurde mit einem High Capacity RNA-to-cDNA-Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) zurücktranskribiert. Die verdünnte cDNA wurde mit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) und 2 pmol Primern, die für iNOS, COX2 oder GAPDH spezifisch sind, gemischt. Die Amplifikation der cDNA wurde mit einem StepOnePlus Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Nach einer anfänglichen Hitzedenaturierung bei 95°C für 10 Minuten wurden die PCR-Bedingungen auf 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 1 Minute für 40 Zyklen eingestellt. Für jede PCR wurde eine entsprechende mRNA-Probe ohne reverse Transkription als Negativkontrolle eingesetzt. Die Quantifizierung der cDNA-Kopienzahl erfolgte anhand einer Standardkurve.

2.12. Statistische Analyse

Daten wurden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Zum Vergleich der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde ein zweiseitiger Student’s t-Test oder eine zweiseitige Varianzanalyse durchgeführt. Wenn die statistische Analyse ergab, dass die Unterschiede zwischen mehreren Gruppen signifikant waren, wurde der Tukey-Post-Hoc-Test für weitere Vergleiche verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software IBM SPSS 22.0 (IBM, Chicago, IL, USA) durchgeführt. P-Werte von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. Gehalt von Atractylenolid I und Atractylenolid III in AME

Unter den bekannten Qualitätskontrollmarkern sind Atractylenolid I und Atractylenolid III in vitro als entzündungshemmende Verbindungen nachgewiesen. Die Ethylacetatfraktion von AME wurde versuchsweise durch den Vergleich von Retentionszeiten und UV-sichtbaren Spektralmustern mit einer Aufstockung authentischer Standards identifiziert. Die HPLC-Chromatogramme sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Gehalt an Atractylenolid I und Atractylenolid III in AME betrug 0,0338 mg/g Extrakt bzw. 0,565 mg/g Extrakt.

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Abbildung 1

HPLC-Chromatogramme von Atractylodes macrocephala-Wasserextrakt (AME). (a, b) Standardmarker. (c, d) AME.

3.2. Wirkung der oralen Verabreichung von AME auf die Expression von Scavenger-Rezeptoren in peritonealen Exsudatzellen von Mäusen

Die intraperitoneale Injektion von Thioglykollat wird üblicherweise verwendet, um eine sterile Peritonitis zu induzieren und peritoneale Makrophagen von Mäusen in Labors anzureichern. Die Mehrzahl der peritonealen Makrophagen stammt von Blutmonozyten ab. Wir sammelten mit dieser Methode peritoneale Exsudatzellen von AME-behandelten Mäusen. CD11b wurde als Marker für Makrophagen verwendet. Scavenger-Rezeptoren wie SRA, CD36 und LOX-1 werden während der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen hochreguliert; daher untersuchten wir die Expression dieser Proteine. SRA, CD36 und LOX-1 wurden fast ausschließlich in CD11b(+)-Zellen exprimiert (Abbildungen 2(a)-2(c)). Der Prozentsatz der SRA(+)CD11b(+)-Zellen in der Kontrollgruppe betrug 66%, und die Behandlung mit 500 mg/kg und 2.500 mg/kg AME erhöhte diese Population signifikant auf 69% bzw. 76%. Die Häufigkeit der CD36(+)CD11b(+)- und LOX-1(+)CD11b(+)-Zellpopulationen in der Kontrollgruppe betrug 95 % bzw. 14 %, und AME bewirkte keine signifikanten Veränderungen in beiden Populationen. Die Zunahme der SRA(+)CD11b(+)-Zellpopulation deutet darauf hin, dass AME die Differenzierung von Blutmonozyten in Makrophagen als Reaktion auf Thioglykollat stimulieren kann.

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Abbildung 2

Scavenger-Rezeptoren, die von Zellen des Peritonealexsudats nach oraler Verabreichung von AME exprimiert werden. Mäusen wurde 10 Tage lang oral AME (500 oder 2500 mg/kg) verabreicht. Peritoneale Exsudatzellen wurden aus Thioglykollat-injizierten Mäusen isoliert und mit FITC-konjugierten Anti-SRA- und PE-konjugierten Anti-CD11b-Abs (a), FITC-konjugierten Anti-CD11b- und PE-konjugierten Anti-CD36-Abs (b) oder FITC-konjugierten Anti-CD11b- und PE-konjugierten Anti-LOX-1-Abs (c) doppelt gefärbt. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert, und es werden repräsentative Punktdiagramme gezeigt. (d) Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar (n=6). P <0,05, P<0,005 gegenüber der Kontrolle.

3.3. Wirkung der oralen Verabreichung von AME auf die Oberflächenexpression von CD86 in LPS-stimulierten Makrophagen

Stimulierende Moleküle wie CD86 auf Makrophagen sind erforderlich, um den Crosstalk zwischen Makrophagen und Th-Zellen zu stärken. Aus AME-behandelten Mäusen isolierte peritoneale Makrophagen wurden 24 Stunden lang mit LPS stimuliert, und die Membranexpression von CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Stimulation mit LPS erhöhte die mittlere Fluoreszenzintensität von CD86 von 5,24 auf 11,24 (Abbildung 3). Die mittlere Fluoreszenzintensität von CD86 in den Gruppen mit 500 und 2.500 mg/kg sank signifikant auf 10,14 bzw. 10,59. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AME die Interaktion zwischen Makrophagen und Th-Zellen beeinflussen kann.

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Abbildung 3

Wirkung von AME auf die Oberflächenexpression von kostimulatorischen Molekülen in LPS-stimulierten Makrophagen. Peritonealmakrophagen, die aus den Kontroll- und AME-Gruppen isoliert wurden, wurden 24 Stunden lang mit 100 ng/ml LPS stimuliert und dann mit PE-konjugiertem Anti-CD86-Antikörper gefärbt. (a) Abgebildet sind repräsentative Histogramme. (b) Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM dar (n=6). (-): ohne LPS, (+): LPS-Behandlung. MFI: mittlere Fluoreszenzintensität. # P<0,005 gegenüber der Kontrolle (-), P<0,05 gegenüber der Kontrolle (+).

3.4. Auswirkungen der oralen Verabreichung von AME auf die entzündliche Zytokinreaktion in Makrophagen und Serum

Wir untersuchten zunächst, ob die orale Verabreichung von AME die entzündliche Reaktion von Makrophagen beeinflusst. Peritoneale Makrophagen aus der Kontroll- oder der hochdosierten AME-Gruppe wurden 24 Stunden lang mit LPS stimuliert, und die Produktion von TNF-α und IL-6 im Überstand wurde gemessen. Es gab keinen Unterschied in der Höhe der TNF-α-Sekretion zwischen der Kontroll- und der AME-Gruppe, aber die Menge an IL-6 war in der AME-Gruppe erhöht (Abbildung 4(a)). Wir fanden auch heraus, dass AME keine Veränderungen der iNOS- und COX-2-Genexpression in den mit LPS stimulierten Zellen hervorrief (Abbildung 4(b)). Als nächstes untersuchten wir die systemische Reaktion von AME-behandelten Mäusen auf die intraperitoneale LPS-Stimulation. AME senkte die Serumspiegel von TNF-α und IL-6 um 20 % bzw. 47 % (Abbildung 5). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die entzündungshemmende Wirkung von AME unabhängig von der Modulation von Makrophagen auftreten kann.

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Abbildung 4

Wirkung von AME auf entzündliche Zytokine und Enzyme in LPS-stimulierten Makrophagen. Makrophagen, die aus der Kontrollgruppe oder der AME-Gruppe (2500 mg/kg) isoliert wurden, wurden 24 Stunden lang mit LPS (100 ng/ml) stimuliert. (a) Die Konzentrationen von Tumornekrosefaktor- (TNF-) α und Interleukin- (IL-) 6 im Überstand wurden mittels ELISA bestimmt. (b) Mittels quantitativer PCR wurde die Expression der iNOS- und COX-2-Gene gemessen. Die Expression der Zielgene wurde auf die GAPDH-Expression normalisiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=6). (-): ohne LPS, (+): LPS-Behandlung. # P<0,005 gegenüber der Kontrolle (-), P<0,05 gegenüber der Kontrolle (+).

Abbildung 5

Auswirkungen der oralen Verabreichung von AME auf die Entzündungsreaktionen im Serum nach intraperitonealer Injektion von LPS. AME (2500 mg/kg) wurde den Mäusen 10 Tage lang oral verabreicht. Das Serum wurde 1 Stunde nach der intraperitonealen Injektion von LPS (1,3 mg/kg) gewonnen, und die Serumspiegel von TNF-α und IL-6 wurden mittels ELISA bestimmt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=10). (-): ohne LPS, (+): LPS-Behandlung. # P<0,001 gegenüber der Kontrolle (-), P <0,05, P <0,001 gegenüber der Kontrolle (+).

3.5. Auswirkungen der oralen Verabreichung von AME auf die Populationen von T- und B-Zellen in der Milz und die Expression von MHC II

Um festzustellen, ob die orale Verabreichung von AME die adaptiven Immunzellen verändert, analysierten wir den prozentualen Anteil der CD4- und CD8-T-Zellen und der B-Zellen in der Milz der Kontroll- und AME-Gruppe. Die CD4(+)-T-Zellpopulation stieg in den Gruppen mit 500 und 2.500 mg/kg signifikant von 23,4 % auf 27,2 % bzw. 26,9 % an (Abbildungen 6(a) und 6(d)). Bei den CD8-T-Zell- und B-Zell-Populationen wurden keine Unterschiede festgestellt (Abbildungen 6(a), 6(b) und 6(d)). MHC-Klasse-II-Moleküle sind für die Präsentation von Antigenen für CD4-T-Zellen erforderlich. Wir analysierten die Milz-Expression der MHC-Klasse-II-Moleküle IA/IE der Maus und stellten fest, dass die mittlere Fluoreszenzintensität der MHC-II-Moleküle in der 2.500 mg/kg AME-Gruppe signifikant von 65,3 auf 68,9 anstieg (Abbildungen 6(c) und 6(e)). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AME Veränderungen im adaptiven Immunsystem hervorruft.

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Abbildung 6

Auswirkungen der oralen Verabreichung von AME auf die Zusammensetzung des adaptiven Immunsystems in der Milz. Milzzellen wurden aus Kontroll- oder AME-Gruppen isoliert und mit einem FITC-konjugierten Anti-CD4-Antikörper und einem PE-konjugierten Anti-CD8-Antikörper (a), einem FITC-konjugierten Anti-CD19-Antikörper (b) oder einem FITC-konjugierten Anti-MHC II-Antikörper (c) doppelt angefärbt und mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. (a-c) Abgebildet sind repräsentative Dot-Blots oder Histogramme. (d-e) Die Balken stellen Mittelwerte±SEM dar (n=6). P <0,001 gegenüber der Kontrolle.

3.6. Auswirkungen der oralen Verabreichung von AME auf die Proliferation von T-Zellen und die Th1/Th2-Zytokinreaktion in Splenozyten

Wir untersuchten die Funktion der T-Zellen in der Milz nach der Behandlung mit AME. Aus Kontroll- oder AME-Gruppen isolierte Splenozyten wurden mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert, einem Mitogen, das die gesamte Population von T-Zellen unabhängig von der Antigenrezeptorspezifität aktiviert. Die 48-stündige Behandlung mit dem Anti-CD3-Antikörper erhöhte die optische Dichte um das 2,6-fache, gemessen mit dem MTS-Test. Es gab keinen Unterschied in der durch Anti-CD3-Antikörper induzierten Proliferation zwischen Kontroll- und AME-Gruppen (Abbildung 7(a)). IFN-γ und IL-4 sind repräsentative Zytokine für Th1- bzw. Th2-Zellen. Wir untersuchten die Sekretion von IFN-γ und IL-4 in Splenozyten, die mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert wurden. Eine signifikante Verringerung der IFN-γ-Sekretion wurde in der 500 mg/kg AME-Gruppe beobachtet, während die IL-4-Sekretion in der 2.500 mg/kg-Gruppe signifikant erhöht war (Abbildung 7(b)). Obwohl keine dosisabhängige Wirkung beobachtet wurde, tendierte AME dazu, die Th2-Reaktion zu fördern.

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Abbildung 7

Auswirkungen von AME auf die Proliferation und Zytokinsekretion von aktivierten T-Zellen in der Milz. Aus Kontroll- und AME-Gruppen isolierte Splenozyten wurden kultiviert und 48 Stunden lang mit Anti-CD3-Antikörper (2 μg/ml) stimuliert. (a) Die proliferative Reaktion der Splenozyten wurde mit dem MTS-Assay bestimmt. (b) Die Zytokinsekretion 48 Stunden nach der Stimulation wurde mittels ELISA gemessen. Die Balken zeigen den Mittelwert±SEM (n=6). (-): ohne Anti-CD3-Antikörper, (+): Behandlung mit Anti-CD3-Antikörper. # P <0,001 gegenüber der Kontrolle (-), P <0,05 gegenüber der Kontrolle (+).

4. Diskussion

In der traditionellen chinesischen Medizin wird erwartet, dass Qi-stärkende Kräuter das Immunsystem stärken. In dieser Studie haben wir uns speziell auf die Entzündungsreaktionen von Makrophagen und T-Zellen konzentriert, die aus Mäusen isoliert wurden, denen AME oral verabreicht wurde.

Die Thioglykollat-induzierte sterile Peritonitis wurde erstmals 1964 von Gallily et al. eingeführt und ist seitdem die am häufigsten verwendete Methode für die Isolierung von primären Makrophagen. Am Tag 4 nach der intraperitonealen Injektion von Thioglykollat steigt die Gesamtzahl der Zellen im Peritonealexsudat um das Fünffache. Unter diesen Zellen sind Makrophagen der vorherrschende Zelltyp, gefolgt von Eosinophilen. Die Quelle der erhöhten Anzahl peritonealer Makrophagen in Mäusen, denen Thioglykollat injiziert wurde, sind aus dem Knochenmark stammende Blutmonozyten. Die Hochregulierung von Scavenger-Rezeptoren erfolgt während des Prozesses der Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen. Scavenger-Rezeptoren, eine Art der angeborenen Makrophagenrezeptoren, sind für die Phagozytose verantwortlich und erkennen spezifisch polyanionische Liganden. Wir verwendeten CD11b und verschiedene Scavenger-Rezeptormarker, um aus Monozyten stammende Makrophagen im Peritonealexsudat zu identifizieren, und stellten fest, dass die CD11b(+)SRA(+)-Zellpopulation in der AME-Gruppe deutlich erhöht war. Dies deutet darauf hin, dass die Verabreichung von AME die Rekrutierung und Differenzierung von Blutmonozyten zu Makrophagen als Reaktion auf Thioglykollat fördert.

LPS wird durch den Toll-like-Rezeptor (TLR)-4/MD-2-Komplex erkannt. TLR4 löst über zwei Adaptormoleküle, MyD88 und TRIF, Entzündungsreaktionen aus. Der MyD88-abhängige Signalweg aktiviert NF-κB und die mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), um Entzündungsgene wie TNF-α und IL-6 zu induzieren. Der TRIF-abhängige Signalweg aktiviert den Interferon-Regulationsfaktor-3, um IFN-β zu produzieren, das für die Hochregulierung kostimulatorischer Moleküle erforderlich ist. Der TRIF-Signalweg ist auch an der Aktivierung von NF-κB und MAPK beteiligt, allerdings verzögert im Vergleich zum MyD88-abhängigen Weg. Die Hochregulierung kostimulatorischer Moleküle ist ausschließlich TRIF-abhängig, während Entzündungsreaktionen gleichzeitig von MyD88 und TRIF abhängig sind. Es gab keine hemmende Wirkung auf die getesteten Entzündungsmarker in Makrophagen aus der AME-Gruppe. Stattdessen war die Expression von CD86 verringert. CD86 auf Makrophagen bindet an CD28 auf Th-Zellen und verstärkt so die Aktivität der Th-Zellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die orale Verabreichung von AME die NF-κB- und MAPK-abhängigen Entzündungsreaktionen in Makrophagen nicht beeinflusst, sondern spezifisch in den TRIF-abhängigen Signalweg eingreift, der nur zur CD86-Expression führt. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob AME in einer pathologischen Situation, in der Makrophagen und Th-Zellen vorherrschen, Veränderungen verursacht.

Das LPS-stimulierte Makrophagen-System ist ein sehr gebräuchliches In-vitro-Modell für die Bewertung der entzündungshemmenden Wirkung von Naturstoffen oder Arzneimittelkandidaten. Bei diesem Modell ist es einfach, mit lipidlöslichen Komponenten das gewünschte Ergebnis zu erzielen, da sie die Zellmembran leicht durchdringen können. Unsere Daten zeigten, dass peritoneale Makrophagen, die aus Mäusen isoliert wurden, denen AME oral verabreicht wurde, ex vivo keine entzündungshemmenden Wirkungen zeigten, was im Widerspruch zu früher berichteten In-vitro-Ergebnissen steht. Im Gegensatz dazu wurde die entzündungshemmende Wirkung von AME bei der Serumantwort von TNF-α und IL-6 nach intraperitonealer Injektion von LPS beobachtet. Diese systemische entzündungshemmende Wirkung wird höchstwahrscheinlich durch die Modulation von Makrophagen vermittelt. Einer der Unterschiede zwischen den In-vivo- und den In-vitro-Bedingungen besteht darin, dass LPS in vivo durch verschiedene Lipoproteine in den Blutkreislauf transportiert und dann durch Hepatozyten abgebaut wird, während dieser Vorgang in vitro nicht nachgeahmt werden kann. Die Clearance von LPS kann eine Überstimulation der Lebermakrophagen verhindern. Ob die systemische entzündungshemmende Wirkung von AME mit der LPS-Clearance in der Leber zusammenhängt, muss noch untersucht werden. Ein ähnliches Ergebnis wurde bei peritonealen Makrophagen erzielt, die aus Mäusen isoliert wurden, denen ein oraler Astragalus membranaceus-Wasserextrakt verabreicht wurde (unveröffentlichte Daten). Astragalus membranaceus und AM gehören zur gleichen Kategorie der Qi-tonisierenden Kräuter. Derzeit wissen wir nicht, ob die entzündungshemmende Wirkung in vivo, die nicht mit einer Modulation der Makrophagen einhergeht, nur bei diesen Heilpflanzen auftritt oder ob es sich um eine gemeinsame Eigenschaft handelt, die durch Qi-tonisierende Heilpflanzen induziert werden kann, und wir müssen weitere Daten sammeln, um Schlussfolgerungen zu ziehen. Darüber hinaus berichteten Li et al., dass Atractylenolid I und 14-Acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, eine Art polyacetylenische Verbindung, die aus AM isoliert wurde, eine molekulare Struktur haben, die mit dem membrangebundenen Glucocorticoidrezeptor interagiert. Ihrer Studie zufolge waren 300 mg/kg orales Atractylenolid I und 30 mg/kg orales Polyacetylen die Mindestdosen, die erforderlich waren, um entzündungshemmende Wirkungen zu zeigen. Die Menge an Atractylenolid I in 2.500 mg/kg AME beträgt lediglich 0,097 mg/kg, eine Dosis, die weit unter dem erforderlichen Minimum liegt. Außerdem muss es bei der Herstellung von AME zu einem Verlust von Polyacetylenen gekommen sein. Es ist möglich, dass AME nicht identifizierte glukokortikoidähnliche Verbindungen enthält, die zu seiner systemischen entzündungshemmenden Wirkung beitragen.

Eine ausreichende Anzahl von T-Zellen ist erforderlich, um eine angemessene Immunantwort aufrechtzuerhalten. Unter normalen Bedingungen wird die Gesamtzahl der T-Zellen durch die Bildung von naiven T-Zellen im Thymus und den Umsatz von peripheren naiven T-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen aufrechterhalten. Bei Mäusen und Menschen kommt es mit zunehmendem Alter zu einer Thymusatrophie, so dass die Zahl der naiven T-Zellen bei beiden Arten abnimmt. Was jedoch die Erhaltung naiver T-Zellen betrifft, so produzieren Mäuse während ihres Lebens naive T-Zellen, während erwachsene Menschen diese Population durch periphere Teilung naiver T-Zellen erhalten. Außerdem ist die Lebensdauer der naiven T-Zellen der Maus 40-mal kürzer als die ihrer menschlichen Gegenstücke. Gedächtnis-T-Zellen werden durch intermittierende Teilung erhalten. Der genaue Mechanismus für das Überleben und die homöostatische Proliferation von naiven und Gedächtnis-T-Zellen ist noch nicht vollständig geklärt, aber er umfasst Signale des TCR/MHC-Komplexes und Zytokine wie IL-7 und IL-15. Die verlängerte Wirkung von Impfstoffen hängt von Gedächtnis-T-Zellen ab, während für die Behandlung von lymphopenischen Erkrankungen naive T-Zellen erforderlich sind. Wir konnten nicht feststellen, ob die CD4-T-Zellpopulation in der Milz, die sich nach der AME-Behandlung vermehrte, aus naiven CD4-T-Zellen oder aus CD4-Gedächtnis-T-Zellen bestand. Eine detaillierte Charakterisierung der Zellfraktion, die auf AME anspricht, wird dabei helfen zu bestimmen, welche Situation für die Anwendung von AME besser geeignet ist.

Bemerkenswert ist, dass in der AME-Gruppe gleichzeitig eine Hochregulierung von MHC-Klasse-II-Molekülen in der Milz auftrat. MHC-Klasse-II-Moleküle sind notwendig, um CD4-T-Zellen mit Antigenen zu versorgen. Wir stellten routinemäßig fest, dass es sich bei der Mehrheit der MHC-Klasse-II-exprimierenden Zellen in der Milz um B-Zellen und bei den übrigen Zellen um Makrophagen und dendritische Zellen handelt. Wir haben nicht geklärt, welche Zelltypen nach der Verabreichung von AME eine Hochregulierung von MHC-Klasse-II-Molekülen zeigten. Die Zunahme der Zahl der CD4-T-Zellen und der Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen in der Milz deutet jedoch darauf hin, dass die Supplementierung von AME zur systemischen Erhaltung von CD4-T-Zellen beiträgt. Die Rolle von IL-4 unter physiologischen Bedingungen besteht darin, die Antikörperreaktion zu verstärken, indem es das Überleben und die Vermehrung von B-Zellen fördert und den Schutz vor Helmintheninfektionen gewährleistet. Die Splenozyten der AME-Gruppen zeigten während der T-Zell-Aktivierung ex vivo eine erhöhte IL-4-Produktion bei gleichzeitig verringerter IFN-γ-Produktion. Diese Ergebnisse legen nahe, dass AME unter normalen Bedingungen die Th2-Reaktion fördert. Im Gegensatz dazu fördert die orale Verabreichung von AM-Glykoprotein die Th1-Antwort, während die Th2-Antwort in einem Allergiemodell verringert wird. Es ist nicht klar, ob diese Verbindung die gesamte Aktivität von AM darstellt. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, ob AME pathologische Th2-Reaktionen verhindert oder verschlimmert.

5. Schlussfolgerung

In dieser Studie haben wir Veränderungen in den Reaktionen von Makrophagen und T-Zellen bei normalen Mäusen nach oraler Verabreichung von AME beobachtet. AME verstärkte die Thioglykollat-induzierte Monozytendifferenzierung im Peritoneum und unterdrückte die LPS-induzierten TNF-α- und IL-6-Spiegel im Serum. Im Gegensatz zu diesen systemischen entzündungshemmenden Effekten waren in Makrophagen, die aus der AME-Gruppe isoliert wurden, keine entzündungshemmenden Wirkungen zu beobachten, mit Ausnahme von Veränderungen in der Expression kostimulatorischer Moleküle. AME beeinflusste auch das adaptive Immunsystem, indem es die Zahl der CD4-T-Zellen und die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen erhöhte und die Th2-Reaktion gegenüber der Th1-Reaktion förderte.

Abkürzungen

AM:	Atractylodes macrocephala Koidz
AME:	AM Wasser-Extrakt
LPS:	Lipopolysaccharid
TNF-α:	Tumor-Nekrose-Faktor-α
IL:	Interleukin
APC:	Antigen präsentierende Zelle
TCR:	T-Zell-Rezeptor
MHC:	Haupthistokompatibilitätskomplex
Th-Zelle:	T-Helferzelle
DW:	Deionisiertes Wasser
FBS:	Fötales Rinderserum
PBS:	Phosphatgepufferte Salzlösung
iNOS:	Induzierbare Stickstoffoxid-Synthase
COX-2:	Cyclooxygenase-2
TLR:	Toll-like receptor
IFN-γ:	Interferon-γ
MAPK:	Mitogen-activated protein kinase.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Dankesworte

Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea unterstützt, das vom Bildungsministerium finanziert wird (2014R1A1A2055052).