Zelluläre und molekulare Reaktionen auf akute Kokainbehandlung in neuronal-ähnlichen N2a-Zellen: Potenzieller Mechanismus für die Resistenz gegen den Zelltod

Materialien

Zellkultur

Die N2a-Zellen (CCL-131, ATCC) wurden in einer Monolayerkultur48 gehalten und wurden häufig für Studien über Drogenmissbrauch14,49,50 oder ZNS-Erkrankungen wie Parkinson51 oder Alzheimer47,52,53 verwendet. Ein Vorteil dieser Zelllinie besteht darin, dass die feinen morphologischen Veränderungen, die auf eine chemische Exposition zurückzuführen sind, aufgrund ihrer größeren Zellgröße leicht erkannt werden können. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente in unserer Studie in phenolrotfreiem RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS durchgeführt. Nach der Aussaat wurden die Zellen in Kulturplatten oder -schalen 4-5 Tage im Inkubator wachsen gelassen, um eine spontane Differenzierung der Neuritenauswüchse zu erreichen. Alle Studien wurden mindestens zweimal wiederholt.

Morphologie

Für grobe zellmorphologische Auswertungen wurden mit Kristallviolett gefärbte Zellen37 mit EVOS Cell Imaging Systems und einem ×40-Objektiv fotomikroskopiert. In einigen Studien wurden die Morphologie oder die Vakuolen der mit Kristallviolett gefärbten Zellen mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop IX-70 von Olympus aufgenommen. Neuritenauswüchse wurden mit der Software Image J (National Institutes of Health) quantifiziert.

Elektrophysiologie

Mit Hilfe von Ganzzell-Patch-Clamps wurden Aufzeichnungen von N2a-Zellen gemacht, die auf Plastikdeckblättern kultiviert wurden. Die Deckgläser wurden dreimal mit einer extrazellulären Aufzeichnungslösung gewaschen, die (in mM) 145 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 10 Glukose und 10 HEPES (312 mOsm, pH 7,4) enthielt, und wurden in dieser Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläser wurden entweder unbehandelt gelassen oder mit 6,25 μM oder 4 mM Kokain direkt in der extrazellulären Lösung während der Aufzeichnung behandelt. Glaselektroden (Widerstand 1-5 MΩ) wurden mit intrazellulärer Lösung gefüllt, die (in mM) 130 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES und 5 EGTA (292 mOsm, pH 7,4) enthält. Die Zellen wurden unter Phasenkontrast mit einem Nikon Eclipse Ti-U Inversmikroskop und einer angeschlossenen DS-Qi1 Monochrom-Digitalkamera visualisiert.

Aufzeichnungen wurden mit einem Axopatch 200B Verstärker (Molecular Devices, CA) gemacht und mit einem Digidata 1440A System (Molecular Devices, CA) digitalisiert. Ionenströme wurden mit einem Spannungsklemmenprotokoll aufgezeichnet (-60 bis 135 mV in 15 mV-Schritten, 250 ms Dauer). Spontane postsynaptische Ströme wurden unter kontinuierlicher Spannungsklemmung bei -80 mV für 2 min aufgezeichnet. Ein Stromklemmenprotokoll (-100 bis 200 pA in 20 pA-Schritten, 800 ms Dauer) wurde verwendet, um die Fähigkeit der N2a-Zellen zu beurteilen, als Reaktion auf eine Strominjektion Aktionspotenziale auszulösen. Die Signale wurden mit 1 kHz gefiltert und mit 10 kHz abgetastet. Die Daten wurden mit der Software pCLAMP 10 (Molecular Devices, CA) erfasst und analysiert.

Behandlungen

Eine bekannte Menge Kokainhydrochlorid wurde unmittelbar vor den Versuchen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als 1 M-Stock aufgelöst. Um die pharmakologischen In-vivo-Konzentrationen von Kokain im Bereich von 1 nM bis 6,25 μM zu simulieren, wurden mehrere Arbeitsvorräte (0,04, 0,2, 0,4, 1, 2, 4, 8, 20, 40, 200 und 400 μM) in PBS hergestellt; ebenso wurden für höhere Kokainkonzentrationen (2, 3 und 4 mM endgültig) Arbeitsvorräte von 80, 120 und 160 mM in PBS hergestellt. Von jedem Arbeitsvorrat wurden 5 μl Kokain pro Vertiefung zugegeben, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen und um pH-Veränderungen im Kulturmedium zu verhindern37. Das Endvolumen in jeder Vertiefung betrug 200 μl. Während die Wahl der niedrigeren Konzentrationen auf Berichten über nano- bis mikromolares Kokain in ZNS-Zellen von Süchtigen13 beruhte, wurden die höheren Konzentrationen auf der Grundlage mehrerer In-vitro-Studien14,15,16 gewählt. Als Kontrollen dienten Zellen mit Medium allein oder mit dem gleichen Volumen an Vehikel (PBS) im Medium, während Medium ohne Zellen als Blindprobe verwendet wurde. In Anlehnung an unsere früheren Studien mit C6-Astroglia-ähnlichen Zellen6 wurden die Kokainbehandlungen in der vorliegenden Studie zu Vergleichszwecken ebenfalls für 1 Stunde durchgeführt. Übrigens lässt die Wirkung von Kokain bei Süchtigen innerhalb dieses Zeitraums bei typischen Mengen und Aufnahmewegen nach33. In einer Untergruppe von Experimenten wurden die Zellen in 96-Well-Platten 30 Minuten lang mit 1 µM YM155, einem Inhibitor des Survivin-Gens, vorbehandelt und anschließend 1 Stunde lang mit Kokain (2-4 mM) ko-behandelt und auf ihre Lebensfähigkeit hin untersucht, während in anderen Studien die Zellen 30 Minuten lang mit 5 μM PIK-75, einem Nrf-224-Inhibitor, vorbehandelt wurden, bevor sie 1 Stunde lang mit Kokain (2-4 mM) ko-behandelt und auf ihre Lebensfähigkeit und ihren GSH-Gehalt hin untersucht wurden.

Lebensfähigkeit und Vakuolisierung

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch die Aufnahme von Kristallviolett-Farbstoff wie zuvor beschrieben54,55 bestimmt. Das Ausmaß der Vakuolisierung in den Zellen wurde in mit Glutaraldehyd fixierten Zellen durch die Aufnahme von neutralrotem Farbstoff quantifiziert, wie zuvor beschrieben56. Der Farbstoff wurde mit 70%igem Ethanol und 0,37%iger Salzsäure extrahiert, und die Absorption bei 540 nm wurde in einem Plattenlesegerät gemessen. Mit Kristallviolett gefärbte Zellen wurden mit einem invertierten IX-70 Olympus-Phasenkontrastmikroskop mit einem ×40-Objektiv fotografiert.

Videomikroskopie

Für die Live-Videografie wurde eine der Okularlinsen des invertierten IX-70 Olympus-Phasenkontrastmikroskops durch ein Standard-Okular-Videokamerasystem ersetzt. Der Ausgang des Videoanschlusses wurde an einen Computer angeschlossen, um die Bilder auf dem Monitor mit dem Softwareprogramm Electronic Ocular -R-AMCap von Zhejiang JinCheng Scientific & Technology Co., Ltd, (HangZhou, China) zu visualisieren. Die Videodokumentation wurde mit einer Geschwindigkeit von 14 Bildern pro Sekunde aufgenommen.

Zellmembranintegritätstest

Die Zellmembranintegrität wurde durch Messung der Freisetzung von zytoplasmatischer LDH mit dem CytoTox 96 nicht-radioaktiven Assay-Kit (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, wurden die Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten 1 Stunde lang mit verschiedenen Kokainkonzentrationen (2, 3 und 4 mM) behandelt. Dann wurden 50 μl des Testmediums in eine neue 96-Well-Platte überführt, mit dem gleichen Volumen der Substratmischung aus dem Kit gemischt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde in einem Plattenlesegerät bei 490 nm gemessen.

Messung der intrazellulären ROS

Zellen in 96-Well-Platten wurden 1 h lang mit Kokain in einer Konzentration von 2, 3 und 4 mM behandelt, gefolgt von einer Färbung mit einem zelldurchlässigen Farbstoff H2DCFDA (10 μM final) für 30 min6. Nach vorsichtigem Waschen und Lufttrocknen der Zellen wurde PBS (100 μl/Vertiefung) hinzugefügt. Die Platten wurden mit einem automatischen Lesegerät (BioTek™ Synergy HTX Multimode-Mikroplattenlesegerät, BioTek Instruments, Winooski, VT) mit einem Anregungsfilter bei 485 nm und einem Emissionsfilter bei 530 nm abgelesen.

Lipidperoxidationstest

Die Zellen wurden mit einer Ausgangsdichte von 0,3 × 106 Zellen pro Vertiefung in Sechs-Well-Platten ausgesät. Die Lipidperoxidation wurde wie zuvor beschrieben57 gemessen. Nach einer 1-stündigen Behandlung mit 2, 3 und 4 mM Kokain wurden die Zellen geerntet und 6 Minuten lang bei 13.000 U/min in einer Tisch-Mikrozentrifuge zentrifugiert. Alle Zellpellets wurden in PBS auf Eis 3 s lang beschallt und in Glasröhrchen überführt. Anschließend wurden die Lysate mit 30 % Trichloressigsäure und 0,37 % Thiobarbitursäure (TBA) versetzt. Die Mischung wurde 10 Minuten lang gekocht, auf Raumtemperatur abgekühlt, in neue Falcon-Röhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei 3038 × g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in eine 96-Well-Platte überführt, und die Absorption bei 535 nm wurde in einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Klares Medium ohne Zellen wurde als Leerwert verwendet.

Allgemeine mitochondriale Stoffwechselaktivität und Membranpotential

Zellen (2 × 104) wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten 1 Stunde lang mit verschiedenen Konzentrationen von Kokain (2, 3 und 4 mM) behandelt. Anschließend wurden die Platten 4 Minuten lang bei 304 × g zentrifugiert, und das kokainhaltige Medium wurde sorgfältig verworfen. Nach der sofortigen Zugabe von frischem Medium zu den Zellen (200 μl) wurden pro Vertiefung 10 μl MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2H-Tetrazolium, Promega) wie bereits berichtet58 zugegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde in einem Mikroplattenlesegerät bei 490 nm gemessen. Das Membranpotenzial wurde gemäß dem früheren Verfahren46 bestimmt. Am Ende der 1-stündigen Behandlung mit Kokain wurden die Monolayer-Zellen zur Fixierung mit 100 μl 0,25 % wässrigem Glutaraldehyd überzogen, das Rh 123 enthielt, um eine Endkonzentration von 2,6 μM für 30 Minuten bei RT zu erreichen. Der Überstand wurde verworfen, die Platten wurden mit Wasser gewaschen und an der Luft im Abzug getrocknet. Schließlich wurden 100 μl 0,1 % Triton×100 in PBS pro Vertiefung zugegeben und 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden mit einem BioTek™ Synergy™ HTX-Multimode-Mikroplattenlesegerät mit einem Anregungsfilter bei 485 nm und einem Emissionsfilter bei 538 nm abgelesen.

Laktatnachweis

Studien, die mit Zellen durchgeführt wurden, die in Medium mit 10 % FBS gezüchtet wurden, ergaben hohe Hintergrundwerte, die auf die Interaktion des Serums mit einigen Komponenten des Kits (Trinity Biotech, Jamestown, NY) zurückzuführen sind. Daher wurde in unseren nachfolgenden Studien vor den Behandlungen ein Medium mit 10 % FBS durch reduziertes Serum (0,1 % FBS) in 96-Well-Mikrotiterplatten (2 × 104 Zellen pro Well) ersetzt. Das Kit-Reagenz wurde in einer chromogenen Lösung aufgelöst, die aus 5,3 mM Vanillinsäure, 2,9 mM 4-Amino-Antipyrin und etwa 4 Einheiten Meerrettichperoxidase bestand. Am Ende der 1-stündigen Kokainbehandlung wurde das Kit-Reagenz direkt in die Vertiefungen gegeben (20 μl pro 200 μl), und die Platten wurden zur Farbentwicklung (5-10 Minuten) bei 37 °C im Inkubator gehalten. Die Absorption der unbehandelten Zellen diente als Kontrolle, während das Medium ohne Zellen als Leerwert verwendet wurde. Die Absorption wurde bei 490 nm in einem Mikroplattenlesegerät gemessen.

NMR-Spektroskopie

Die Freisetzung von Laktat aus den Zellen wurde durch Protonen (1H+) NMR-Spektroskopie nachgewiesen. Da die Menge an Serum bei dieser Methode nicht stört, verwendeten wir 10 % FBS in Medium in 96-Well-Mikrotiterplatten (2 × 104 Zellen/200 μl pro Well). Am Ende der 1-stündigen Kokainbehandlung wurde das Medium (0,15 ml pro Vertiefung) aus allen Wiederholungen (n = 12) jeder Behandlung in den beschrifteten Röhrchen gepoolt (1,8 ml). Das Medium aus den unbehandelten Zellen wurde als Kontrolle verwendet. Da die behandelten Proben 2-4 mM Kokain enthielten, wurde dem Medium-Leerwert Kokain (4 mM final) zugesetzt. Die NMR-Analysen wurden auf einem Bruker Avance 800 (\(\nu _0\) = 800,23 MHz) durchgeführt, der mit einer TCI 800S6 H-C/N-D-05 Z-Kryosonde ausgestattet ist (die maximale z-Feldgradientenstärke beträgt 48 G/cm). Um ein eindimensionales (1D) NMR-Spektrum zu erhalten, wurden 16 Transienten aufgenommen und mit einer Aufnahmeverzögerung von 3 s ko-addiert. Es wurden 32.000 Datenpunkte verwendet, um eine spektrale Breite von 7500 Hz zu erhalten. Der dominante Wasserpeak bei 4,75 ppm im Spektrum wurde mit Hilfe der WATERGATE W5-Pulssequenz20 eliminiert. Eine Bandbreite von 3000 Hz auf jeder Seite des Wasserpeaks wurde als spektrales Fenster für die Beobachtung der gelösten Peaks verwendet, indem eine Verzögerungszeit von 333,3 μs für die WATERGATE-Pulsfolgen eingesetzt wurde. Ein externer Standard, 3,3 mM wässrige DMSO-Lösung, wurde für die Quantifizierung des Laktats in der Probenlösung hergestellt.

Messung von H2S im Zellkulturmedium

Zellen wurden mit einer Ausgangsdichte von 2 × 104 pro Vertiefung in 96-Well-Platten ausgesät. Vor der Kokainbehandlung wurde den Zellen 1,64 % wässriges Zinkacetat59,60 (Endwert: 0,041 %) zugesetzt, um flüchtiges H2S-Gas während der Kokainbehandlung in Zinksulfid umzuwandeln. Nach 1 h Behandlung mit 2, 3 und 4 mM Kokain wurden 17,453 mM N,N-Dimethyl-p-phenylendiaminsulfat in 7,2 M HCl (Endwert: 2,55 mM) und 26,18 mM FeCl3 in 1,2 M HCl (Endwert: 3,83 mM) in die Vertiefungen gegeben und vorsichtig geschüttelt. Blasen im Medium wurden durch Zugabe von 5 μl kaltem Ethanol in alle Vertiefungen entfernt, kurz bevor die Platten bei 670 nm in einem Mikroplattenlesegerät abgelesen wurden.

ATP-Biolumineszenz-Assay

Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten wurden 1 Stunde lang mit verschiedenen Kokainkonzentrationen (2, 3 und 4 mM) behandelt. Das Gesamt-ATP wurde mit dem Biolumineszenz-ATP-Assay-Kit für somatische Zellen (FLASC, Sigma-Aldrich) gemäß der vom Hersteller gelieferten Anleitung für das Kit gemessen. Kurz gesagt wurden am Ende der Behandlung 75 μl der Somatic Cell ATP-freisetzenden Lösung pro Vertiefung hinzugefügt, um die Zellen zu lysieren. Dann wurden 50 μl Lysat in neue weiße 96-Well-Platten mit klarem Boden überführt, die bereits 50 μl des ATP-Assay-Mix-Enzyms unter reduziertem Licht enthielten. Die Lumineszenz wurde sofort mit einem BioTek™ Synergy™ HTX Multimode-Mikroplattenlesegerät gemessen.

Isolierung von RNA und cDNA-Synthese

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 106 in Kulturschalen mit 100 mm Durchmesser ausgesät. Zum Zeitpunkt der Behandlung erreichten die Zellen etwa 65-70 % Konfluenz. Nach einer 1-stündigen Behandlung mit 2-4 mM Kokain wurden die Zellen durch Auskratzen geerntet und 5 Minuten lang bei 1125 × g zentrifugiert. Die Gesamt-RNA wurde gemäß dem vom Hersteller (Qiagen Sciences, German Town, MD) gelieferten Protokoll mit Hilfe von RNeasy mini spin columns isoliert. Die Säule wurde mit DNase I (Qiagen Sciences) behandelt. Die Gesamt-RNA von der Säule wurde mit 20 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Für die Quantifizierung wurde die RNA auf Eis in RNase-freiem Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnt. Die Menge der Gesamt-RNA wurde mit dem Spektralphotometer Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) gemessen. Die RNA wies bei 260/280 nm ein Verhältnis von >1,95 auf und wurde anschließend für die cDNA-Synthese verwendet. Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde zur Herstellung von cDNA unter Verwendung eines iScript cDNA-Synthese-Kits (Bio-Rad, Hercules, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Relative Expression durch quantitative RT-PCR

Die Analyse der Genexpression von Nrf-2, Survivin (Birc5) und GAPDH durch qPCR wurde in einem iCycler-Thermocycler mit MyiQ-Detektionssystem (Bio-Rad) unter Verwendung von iQ SYBR Green-Supermix durchgeführt. Nrf-2-, Survivin- und GAPDH-Produkte wurden durch separate PCR-Reaktionen synthetisiert, die in einem Endvolumen von 20 μl mit 2 μl cDNA-Probe und 500 nM spezifischen Primern durchgeführt wurden. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, während die Schmelzkurvenanalyse nach der PCR bei 55-95 °C durchgeführt wurde. Die relative Quantifizierung der Genexpressionen wurde nach der 2-△△CT-Methode61 mit GAPDH als endogener Kontrolle durchgeführt. Die für die Analysen verwendeten Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Gesamt-GSH-Assay

Nach der Behandlung mit verschiedenen Kokain-Konzentrationen (2-4 mM) in komplettem Medium für 1 h in 96-Well-Mikrotiterplatten wurden die Zellen mit 0,25%igem Glutaraldehyd für 30 min fixiert, anschließend dreimal vorsichtig gewaschen und an der Luft getrocknet. Das gesamte zelluläre GSH wurde wie zuvor beschrieben62 bestimmt. Die Absorption wurde bei 412 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

Zubereitung von Ganzzell-Lysaten

Für Enzymtests wurden die Zellen in einer Dichte von 2 × 106 in Kulturschalen mit 100 mm Durchmesser ausgesät. Nach einer 1-stündigen Behandlung mit 2-4 mM Kokain wurden die Zellen mit Zellschabern geerntet. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1620 × g wurden die Zellpellets bis zur weiteren Verwendung bei -70 °C gelagert. Am Tag der Tests wurden die Pellets in 0,5 ml PBS resuspendiert und zweimal 15 Sekunden lang auf Eis beschallt. Der Inhalt wurde in Eppendorf-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 5000 rpm mikrozentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Röhrchen überführt und für die Enzymtests verwendet. Die Proteinkonzentration in jedem Lysat wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce, Rockford, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt, wobei Rinderserumalbumin als Standardreferenz verwendet wurde.

Catalase-Assay

Dieser Assay wurde gemäß der früheren Methode durchgeführt63. Die Reaktionsmischung (450 μl) in einer Quarzküvette enthielt 50 μl Zelllysat (60 μg), 250 μl 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 μl 30 mM H2O2 (10 mM final) gestartet. Die Abnahme der Absorption bei 240 nm wurde 2 Minuten lang in einem Genesys 10 S UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Vernon Hills, IL) überwacht. Die Enzymaktivität wurde anhand des Extinktionskoeffizienten von 0,00706 pro mmol pro mm berechnet, und die Einheit der Enzymaktivität wurde als mmol H2O2 ausgedrückt, das pro Minute pro mg Protein abgebaut wird. Anschließend wurde die Enzymaktivität der behandelten Proben mit der Kontrolle (100 %) verglichen.

GPx-Assay

Der Assay wurde nach dem veröffentlichten Verfahren durchgeführt64. Das Reaktionsgemisch (500 μl) enthielt 1 mM GSH, 0,15 mM NADPH, 0,12 Einheiten Glutathionreduktase (GR), 0,1 mM Natriumazid in 0,1 M Kaliumphosphat (pH 7,0 mit 1 mM EDTA. Natriumazid wurde der Reaktionsmischung zugesetzt, um die endogene Katalaseaktivität zu hemmen. Die Reaktionsmischung wurde mit 60 μg der Probe 10 Minuten lang ohne NADPH inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von NADPH und H2O2 in einer Endkonzentration von 150 μM gestartet. Die Geschwindigkeit des NADPH-Verbrauchs wurde 3 Minuten lang bei 340 nm überwacht. Eine Einheit GPx-Aktivität wurde als die Menge an Enzym definiert, die erforderlich ist, um 1 μmol NADPH/min im gekoppelten Assay zu verbrauchen, und die Aktivität wurde pro mg Protein ausgedrückt. Anschließend wurde die Enzymaktivität der behandelten Proben mit der Kontrolle (100 %) verglichen.

Statistische Analyse

Die experimentellen Ergebnisse (n = Anzahl der Vertiefungen, die aus mindestens zwei verschiedenen Experimenten zusammengefasst wurden) wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Alle Balkendiagramme wurden mit der GraphPad Prism Software, Version 3.00 (San Diego, CA), erstellt. Die Daten wurden mittels einseitiger ANOVA auf ihre Signifikanz hin analysiert und anschließend mittels Dunnett- oder Bonferroni-Mehrfachvergleichstests verglichen. Die Testwerte von P < 0,05 und P < 0,01 wurden als signifikant bzw. hochsignifikant angesehen.