Efectul extractului de apă de Atractylodes macrocephala Koidz administrat pe cale orală asupra răspunsului inflamator al macrofagelor și al celulelor T la șoareci

Abstract

Rizomul de Atractylodes macrocephala Koidz (AM) este un constituent al diferitelor rețete compuse de stimulare a Qi. Am evaluat răspunsurile inflamatorii în macrofagele și celulele T izolate de la șoareci în urma administrării orale de extract de apă de AM (AME). Celulele din exsudatul peritoneal au fost izolate de la șoareci injectați cu tioglicolat și au fost examinate modificările receptorilor scavenger. Macrofagele peritoneale au fost stimulate cu lipopolizaharidă (LPS). Au fost evaluate, de asemenea, răspunsurile serice la citokine la injecția intraperitoneală de LPS. Splenocitele au fost izolate și au fost măsurate compoziția și răspunsurile funcționale ale acestora. Conținutul de atractylenolide I și atractylenolide III, ingrediente antiinflamatorii cunoscute, în AME a fost de 0,0338 mg/g de extract și, respectiv, de 0,565 mg/g de extract. AME a crescut numărul de celule SRA(+)CD11b(+) ca răspuns la tioglicolat. Macrofagele peritoneale izolate din grupul AME nu au prezentat modificări în ceea ce privește markerii inflamatori, cum ar fi factorul de necroză tumorală- (TNF-) α, interleukina- (IL-) 6, sinteza oxidului nitric inductibil și ciclooxigenaza-2, dar au prezentat o scădere a expresiei CD86. În mod interesant, AME a scăzut nivelurile serice de TNF-α și IL-6 la injectarea intraperitoneală de LPS. În ceea ce privește sistemul imunitar adaptiv, AME a crescut populația de celule T CD4(+) și expresia moleculei de clasă II a complexului major de histocompatibilitate în splină, iar splenocitele cultivate din grupul AME au prezentat o producție crescută de IL-4 concomitent cu scăderea producției de interferon-γ în timpul activării celulelor T. AME a promovat refacerea macrofagelor peritoneale în timpul răspunsului inflamator, dar activitatea sa antiinflamatorie nu pare să fie mediată de modularea activității macrofagelor. AME a modificat, de asemenea, statutul imunitar al celulelor T CD4, promovând răspunsul Th2.

1. Introducere

Inflamația este un răspuns de protecție pentru a elimina stimulii dăunători, iar celulele imune sunt principalii participanți la acest proces. În funcție de modalitatea de recunoaștere a antigenului și de capacitatea de a genera un răspuns de memorie, celulele imune sunt împărțite în sistemul imunitar înnăscut și sistemul imunitar adaptativ . Celulele imune innate, cum ar fi macrofagele și celulele dendritice, reacționează instantaneu la antigen cu o specificitate limitată a receptorilor . Celulele imunitare adaptative, formate din celule T și celule B, sunt specifice antigenului, inițiază un răspuns la antigenul care a pătruns în țesutul limfoid periferic și generează un răspuns de memorie . Celulele imune înnăscute sunt principalii actori în stadiile incipiente ale inflamației, dar, în timp, celulele imune adaptative preiau controlul.

Macrofagele rezidente în țesut joacă un rol cheie în imunitate și în integritatea țesuturilor . Majoritatea macrofagelor tisulare sunt derivate din precursori embrionari . În condiții de echilibru, populațiile lor sunt menținute prin longevitatea lor și prin proliferare locală, iar unele macrofage sunt reaprovizionate de celulele derivate din monocite din sânge . În timpul inflamației, monocitele derivate din măduva osoasă sunt recrutate la fața locului și se diferențiază în macrofage . Macrofagele elimină agenții patogeni și antigenii prin fagocitoză și induc răspunsuri inflamatorii prin producerea de citokine și enzime, cum ar fi factorul de necroză tumorală- (TNF-) α, interleukina- (IL-) 6, oxidul nitric sintetizat inductibil (iNOS) și ciclooxigenază- (COX-) 2. În plus, macrofagele sunt un tip de celule prezentatoare de antigen (APC) profesionale care prezintă antigene celulelor T .

Celele T, care constau în principal din celule T CD4 și celule T CD8, sunt activate atunci când receptorii celulelor T (TCR) intră în contact cu peptidele antigenice legate de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC) de pe APC . Celulele T CD4, care reprezintă mai mult de două treimi din celulele T, pot fi diferențiate în diferite celule T helper (Th) efectoare, cum ar fi Th1, Th2, Th17, T helper folicular și celule reglatoare T . Dintre aceste subseturi, celulele Th1 și Th2 au fost primele tipuri care au fost definite. Celulele Th1 secretă niveluri ridicate de interferon- (IFN-) γ și sunt eficiente în apărarea împotriva agenților patogeni intracelulari prin activarea macrofagelor, în timp ce celulele Th2 secretă interleukina- (IL-) 4, IL-5 și IL-13 și protejează gazda de infecțiile cu helminți prin recrutarea de eozinofile și mastocite . Deși aceste celule T helper sunt importante pentru apărarea gazdei, activarea cronică a oricărui tip de celule Th poate provoca tulburări mediate imunitar. Celulele Th1 joacă un rol critic în autoimunitatea specifică de organ și în tulburările inflamatorii cronice, iar celulele Th2 sunt responsabile de inflamația alergică .

Rizomul de Atractylodes macrocephala Koidz (AM), aparținând Compositae, a fost utilizat pentru tratamentul defectelor funcționale ale sistemului digestiv, cum ar fi pierderea poftei de mâncare, distensia abdominală și diareea. Conform medicinei tradiționale chineze, AM revigorează Qi prin rezolvarea retenției anormale de lichid în tractul gastrointestinal. AM este un constituent al diferitelor rețete compuse de stimulare a Qi. În medicina tradițională chineză, una dintre funcțiile esențiale ale Qi este apărarea. Din acest motiv, se consideră că plantele care stimulează Qi îmbunătățesc sistemul imunitar. Deoarece plantele de stimulare a Qi sunt administrate în mod preventiv pentru a îmbunătăți starea imunitară a persoanelor fără defecte evidente, este necesar să se evalueze modul în care sistemul imunitar poate fi modificat la persoanele normale în urma administrării de AM. În ciuda utilizării sale frecvente, au existat puține studii care să exploreze efectele AM asupra sistemului imunitar.

AM conține mai multe sesquiterpenoide bioactive, cum ar fi atractylenolide I, atractylenolide II și atractylenolide III și poliacetilene . Tratamentul in vitro al macrofagelor cu atractylenolide I, atractylenolide III și unii compuși poliacetilenici a inhibat expresia TNF-α și iNOS indusă de lipopolizaharide (LPS) . Administrarea orală a acestor componente solubile în lipide a arătat o activitate antiinflamatoare la șoareci . Cu toate acestea, majoritatea preparatelor tradiționale pe bază de plante sunt decocturi pe bază de apă, ceea ce duce la un randament scăzut al componentelor liposolubile active din punct de vedere farmacologic. În plus, poliacetilenele pot fi ușor distruse în apă clocotită. Prin urmare, am dorit să analizăm dacă apar răspunsuri antiinflamatorii în macrofagele izolate de la șoareci cărora li s-a administrat AM extras în apă clocotită (AME). De asemenea, am examinat efectul AME asupra răspunsului inflamator seric. În cele din urmă, am examinat compoziția și răspunsul funcțional al splenocitelor pentru orice alterare a sistemului imunitar adaptativ după suplimentarea cu AME.

2. Materiale și metode

2.1. Pregătirea probei

AM provenit din Eusung (Coreea de Sud) a fost achiziționat de la E-Pulip Co., Ltd. (Lot. EPL1356-4) (Seul, Coreea de Sud). Un exemplar voucher (nr. 2013-AM) a fost depus în Laboratorul de imunologie vegetală, Universitatea Kyung Hee. Pe scurt, 100 g de probă a fost măcinată, extrasă cu 1 L de apă deionizată (DW) într-un aparat cu reflux și manta de încălzire timp de 2 h la 95°C și filtrată prin hârtie de filtru Whatman numărul 2 (Whatman International, Kent, Anglia). Extractul a fost concentrat cu ajutorul unui evaporator rotativ și liofilizat în vid. Randamentul de AME a fost de 37,7%. Pentru analiza prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), 0,4 g de AME a fost dizolvat în 10 ml de DW și sonicat timp de 5 minute la 25°C. Extractul a fost adăugat în acetat de etil, agitat pentru a se amesteca și lăsat să stea timp de 1 minut. Stratul superior de acetat de etil a fost transferat și această procedură a fost repetată de trei ori. Stratul final de acetat de etil a fost concentrat și liofilizat.

2.2. HPLC

Eșantioanele au fost analizate cu un sistem HPLC în fază inversă (Shimadzu 20A, Kyoto, Japonia) care a constat dintr-un autosampler (SIL-20A), o pompă binară (LC-20AD) și un detector cu rețea de fotodiode (SPD-20A) și a fost echipat cu o coloană YMC-Triart C18 (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kyoto, Japonia). Fluxurile de gradient pentru sistemul cu doi solvenți (solvent A, 0,05% acid fosforic în apă; solvent B, acetonitril) au fost următoarele: 85% A/15% B la 0 min, 85% A/15% B la 5 min, 50% A/50% B la 15 min, 50% A/50% B la 20 min, 40% A/60% B la 25 min, 40% A/60% B la 30 min, 15% A/85% la 35 min, 15% A/85% la 40 min, 85% A/15% la 42 min și 85% A/15% la 45 min. Debitul fazei mobile a fost de 1,0 ml/min, cu un volum de injecție de 10 μl. Detecția a fost efectuată la 220 nm pentru atractilenolida III (Sigma, St. Louis, MO, SUA) sau la 280 nm pentru atractilenolida I (Sigma).

2.3. Animale

Șoareci masculi Balb/c în vârstă de șapte săptămâni au fost obținuți de la SamTaco (Osan, Coreea de Sud) și adăpostiți într-o instalație pentru animale fără agenți patogeni, cu temperatură și umiditate controlate, cu un ciclu lumină-întuneric de 12 ore. Toate animalele au fost supuse unei săptămâni de ajustare înainte de experimente. Dozele au fost determinate folosind un calcul extrapolat din diferența de suprafață corporală dintre un șoarece și un om . Doza recomandată de AM pentru un om adult de 60 kg este de 8-24 g de plantă brută pe zi sau 3-9 g de extract pe zi (pe baza randamentului de extracție din acest studiu). Doza pentru șoarece poate fi determinată după cum urmează: o doză echivalentă pentru om de 50-150 mg/kg × 12,3 (coeficientul de conversie) = o doză pentru șoarece de 615-1.845 mg/kg. Pe baza acestui interval de doze, am ales doze de 500 mg/kg și 2.500 mg/kg pentru acest studiu. Animalele au fost repartizate în mod aleatoriu în grupuri experimentale. AME a fost administrat prin gavare orală o dată pe zi, timp de 10 zile. Nu au existat diferențe în ceea ce privește greutatea corporală între grupuri în timpul perioadei experimentale. Protocolul pentru animale a fost aprobat de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Kyung Hee (KHUASP(SE)-15-012), iar șoarecii au fost îngrijiți în conformitate cu specificațiile Consiliului Național de Cercetare al SUA pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (1996).

2.4. Prepararea macrofagelor

Pentru izolarea macrofagelor, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 2 ml de tioglicolat steril de 3,5% (BD, Sparks, MD, SUA) cu 4 zile înainte de sacrificare. La sfârșitul experimentului, șoarecii au fost sacrificați prin dislocare cervicală, iar celulele din exsudatul peritoneal au fost izolate aseptic prin spălare peritoneală cu DMEM rece (Hyclone, Logan, UT, SUA) care conține 10% ser fetal de bovine (FBS; Hyclone) și 1% penicilină-streptomicină. După centrifugare, celulele au fost resuspendate și numărate cu ajutorul unui contor celular TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA).

2.5. Prepararea splenocitelor

Pentru izolarea splenocitelor, splinele au fost obținute aseptic la sfârșitul experimentului. După dezagregarea splinei între lame de sticlă în RPMI 1640 (Hyclone) cu 1% FBS și 1% penicilină-streptomicină, celulele au fost filtrate printr-un filtru celular de 70 μm. După centrifugare, globulele roșii au fost lizate cu ajutorul tamponului de liziere BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, SUA). Celulele au fost resuspendate în RPMI 1640 cu 10% FBS și 1% penicilină-streptomicină și au fost numărate cu ajutorul unui T20 Cell Counter.

2.6. Injectarea intraperitoneală de LPS

Șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 1,3 mg/kg LPS (serotip 055:B5, Sigma) la sfârșitul experimentului. După 1 h, șoarecii au fost anesteziați cu eter și sângele a fost recoltat prin puncție cardiacă. Serul a fost obținut și depozitat la -20°C până la analiză.

2.7. Cultură celulară

Cele de exsudat peritoneal au fost plasate în plăci cu 6 puțuri sau în vase de 60 mm și incubate peste noapte la 37°C. După îndepărtarea celulelor neaderente, celulele atașate au fost stimulate cu 100 ng/ml LPS timp de 24 h. Supernatantul și celulele au fost colectate pentru testele ulterioare. Splenocitele au fost plasate în plăci cu 24 de godeuri și stimulate cu 2 μg/ml anticorp anti-CD3 (BD Biosciences) timp de 48 h. Supernatantul a fost colectat pentru analiza citokinelor.

2.8. Citometrie în flux

Celele au fost spălate de două ori în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și resuspendate la 1 × 106 celule/ml în tampon FACS (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). Celulele au fost blocate cu anticorp anti-șobolan CD16/CD32 de șobolan (BD Biosciences) la 4°C timp de 5 minute și apoi au fost colorate cu anticorp anti-șobolan SR-AI conjugat cu fluoresceină, anticorp anti-șobolan LOX1 conjugat cu PE (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA), anticorp anti-șobolan CD36 conjugat cu PE, CD11b conjugat cu FITC, anti-CD11b conjugat cu PE, CD86 anti-șoarece conjugat cu PE, CD4 anti-șoarece conjugat cu FITC, CD8a anti-șoarece conjugat cu PE, CD19 anti-șoarece conjugat cu FITC și IA/IE anti-șoarece conjugat cu FITC (BD Biosciences) (toți anticorpii au fost diluați 1:100) timp de 30 de minute la gheață, în întuneric. Pentru a evidenția legarea nespecifică au fost utilizați anticorpi de izotip corespunzători. Celulele au fost spălate și resuspendate în tampon FACS. Un total de 10.000 de evenimente au fost achiziționate pe un citometru de flux Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, SUA), iar datele au fost procesate cu ajutorul software-ului Kaluza (Beckman Coulter).

2.9. Analiza citokinelor

Nivelurile de TNF-α, IL-6, IFN-γ și IL-4 în supernatante și seruri au fost determinate cu ajutorul seturilor ELISA pentru șoareci BD OptEIA (BD Biosciences) în conformitate cu protocolul producătorului.

2.10. Proliferation Assay

Splenocitele (4 × 105) în plăci cu 96 de godeuri au fost stimulate cu mAb anti-CD3 solubil (2 μg/ml) timp de 48 h. Proliferarea celulară a fost determinată cu ajutorul kitului de testare a proliferării celulare CellTiter96 One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, SUA).

2.11. Izolarea ARN-ului și PCR în timp real

ARN-ul total a fost izolat cu ajutorul unui kit de purificare a ARN-ului total FavorPrep (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwan), iar ADNc a fost transcris invers cu ajutorul unui kit High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). ADNc diluat a fost amestecat cu Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems) și 2 pmol de primeri specifici pentru iNOS, COX2 sau GAPDH. Amplificarea ADNc a fost realizată cu ajutorul unui sistem PCR în timp real StepOnePlus (Applied Biosystems). După denaturarea termică inițială la 95°C timp de 10 minute, condițiile PCR au fost stabilite la 95°C timp de 15 secunde și 60°C timp de 1 minut pentru 40 de cicluri. Pentru fiecare PCR, a fost inclusă o probă corespunzătoare de ARNm fără transcriere inversă ca martor negativ. Cuantificarea numărului de copii de ADNc s-a realizat cu ajutorul unei curbe standard.

2.12. Analiză statistică

Datele au fost prezentate ca medie, eroare standard a mediei (SEM). Pentru a compara diferențele dintre grupuri s-a aplicat testul t al lui Student cu două fețe sau analiza varianței în două direcții. În cazul în care analiza statistică a arătat că diferențele dintre mai multe grupuri au fost semnificative, s-a utilizat testul Tukey post hoc pentru comparații suplimentare. Toate analizele statistice au fost efectuate cu software-ul IBM SPSS 22.0 versiunea 22.0 (IBM, Chicago, IL, SUA). Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative.

3. Rezultatele

3.1. Conținutul de atractilenolidă I și atractilenolidă III în AME

Printre markerii de control al calității cunoscuți, atractilenolida I și atractilenolida III sunt compuși antiinflamatori verificați in vitro . Fracția de acetat de etil provenită din AME a fost identificată cu titlu provizoriu, utilizând un aport de standarde autentice, prin compararea timpilor de retenție și a modelelor spectrale UV-visible. Cromatogramele HPLC sunt prezentate în figura 1. Conținutul de atractylenolide I și atractylenolide III în AME a fost de 0,0338 mg/g de extract și, respectiv, de 0,565 mg/g de extract.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 1

Cromatograme HPLC ale extractului apos din apă de Atractylodes macrocephala (AME). (a, b) Markerii standard. (c, d) AME.

3.2. Efectul administrării orale de AME asupra expresiei receptorilor Scavenger în celulele din exudatul peritoneal de șoarece

Injecția intraperitoneală de tioglicolat este folosită în mod obișnuit pentru a induce peritonita sterilă și pentru a îmbogăți macrofagele peritoneale de la șoareci în laboratoare . Majoritatea macrofagelor peritoneale sunt derivate din monocitele din sânge . Am colectat celule de exsudat peritoneal de la șoareci tratați cu AME folosind această metodă. CD11b a fost utilizat ca marker pentru macrofage. Receptorii Scavenger, cum ar fi SRA, CD36 și LOX-1, sunt supraregulați în timpul diferențierii monocitelor în macrofage ; prin urmare, am examinat expresia acestor proteine. SRA, CD36 și LOX-1 au fost exprimate aproape exclusiv în celulele CD11b(+) (figurile 2(a)-2(c)). Procentul de celule SRA(+)CD11b(+) în grupul de control a fost de 66%, iar tratamentul cu 500 mg/kg și 2.500 mg/kg AME a crescut semnificativ această populație la 69% și, respectiv, 76%. Frecvențele populațiilor de celule CD36(+)CD11b(+) și LOX-1(+)CD11b(+) în grupul de control au fost de 95% și, respectiv, 14%, iar AME nu a indus modificări semnificative în ambele populații. Creșterea populației de celule SRA(+)CD11b(+) indică faptul că AME poate stimula diferențierea monocitelor din sânge în macrofage ca răspuns la tioglicolat.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 2

Receptorii Scavenger exprimați de celulele exsudatului peritoneal după administrarea orală de AME. Șoarecilor li s-a administrat AME pe cale orală (500 sau 2500 mg/kg) timp de 10 zile. Celulele de exsudat peritoneal au fost izolate de la șoareci injectați cu tioglicolat și au fost colorate de două ori cu Abs anti-SRA conjugat cu FITC și Abs anti-CD11b conjugat cu PE (a), Abs anti-CD11b conjugat cu FITC și Abs anti-CD36 conjugat cu PE (b), sau Abs anti-CD11b conjugat cu FITC și Abs anti-LOX-1 conjugat cu PE (c). Celulele au fost analizate cu ajutorul citometriei în flux și sunt prezentate diagrame de puncte reprezentative. (d) Barele reprezintă media ± SEM (n=6). P <0,05, P<0,005 față de control.

3.3. Efectul administrării orale de AME asupra expresiei CD86 de suprafață la macrofagele stimulate de LPS

Molacolinele de stimulare, cum ar fi CD86 pe macrofage, sunt necesare pentru a întări legătura încrucișată dintre macrofage și celulele Th . Macrofagele peritoneale izolate de la șoareci tratați cu AME au fost stimulate cu LPS timp de 24 h, iar expresia membranară a CD86 a fost măsurată cu ajutorul citometriei în flux. Stimularea cu LPS a crescut intensitatea medie de fluorescență a CD86 de la 5,24 la 11,24 (figura 3). Intensitatea medie de fluorescență a CD86 în grupurile cu 500 și 2 500 mg/kg a scăzut semnificativ la 10,14 și, respectiv, 10,59. Aceste rezultate indică faptul că AME poate afecta interacțiunea dintre macrofage și celulele Th.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 3

Efectul AME asupra expresiei de suprafață a moleculelor costimulatoare în LPS-macrofage stimulate de LPS. Macrofagele peritoneale izolate din grupurile de control și AME au fost stimulate cu 100 ng/ml LPS timp de 24 h și apoi colorate cu anticorpul anti-CD86 conjugat cu PE. (a) Sunt prezentate histograme reprezentative. (b) Barele reprezintă media ± SEM (n=6). (-): fără LPS, (+): tratament cu LPS. MFI: intensitatea medie a fluorescenței. # P<0,005 față de control (-), P<0,05 față de control (+).

3,4. Efectele administrării orale de AME asupra răspunsului inflamator cu citokine în macrofage și ser

Am examinat mai întâi dacă administrarea orală de AME afectează răspunsul inflamator al macrofagelor. Macrofagele peritoneale din grupul de control sau din grupul cu doze mari de AME au fost stimulate cu LPS timp de 24 h și s-a măsurat producția de TNF-α și IL-6 în supernatant. Nu a existat nicio diferență în ceea ce privește nivelul de secreție de TNF-α între grupurile de control și AME, dar nivelul de IL-6 a fost crescut în grupul AME [Figura 4(a)]. De asemenea, am constatat că AME nu a indus nicio modificare a expresiei genelor iNOS și COX-2 în celulele stimulate cu LPS [Figura 4(b)]. În continuare, am examinat răspunsul sistemic al șoarecilor tratați cu AME la stimularea intraperitoneală cu LPS. AME a scăzut nivelurile serice de TNF-α și IL-6 cu 20% și, respectiv, 47% (Figura 5). Aceste constatări indică faptul că activitatea antiinflamatorie a AME poate avea loc independent de modularea macrofagelor.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Figura 4

Efectul AME asupra citokinelor și enzimelor inflamatorii în LPS-macrofage stimulate de LPS. Macrofagele izolate din grupul de control sau din grupul AME (2500 mg/kg) au fost stimulate cu LPS (100 ng/ml) timp de 24 h. (a) Nivelurile factorului de necroză tumorală- (TNF-) α și ale interleukinei- (IL-) 6 în supranatural au fost determinate prin ELISA. (b) PCR cantitativă a fost utilizată pentru a măsura expresia genelor iNOS și COX-2. Expresia genelor țintă a fost normalizată la expresia GAPDH. Datele reprezintă media ± SEM (n=6). (-): fără LPS, (+): tratament cu LPS. # P<0,005 față de martor (-), P<0,05 față de martor (+).

Figura 5

Efectele administrării orale de AME asupra răspunsurilor inflamatorii serice după injectarea intraperitoneală de LPS. AME (2500 mg/kg) a fost administrat pe cale orală la șoareci timp de 10 zile. Serul a fost obținut la 1 h după injectarea intraperitoneală de LPS (1,3 mg/kg) și nivelurile serice de TNF-α și IL-6 au fost determinate prin ELISA. Datele reprezintă media ± SEM (n=10). (-): fără LPS, (+): tratament cu LPS. # P<0,001 față de control (-), P<0,05, P<0,001 față de control (+).

3,5. Efectele administrării orale de AME asupra populațiilor de celule T și B splenice și a expresiei MHC II

Pentru a determina dacă administrarea orală de AME modifică celulele imune adaptative, am analizat procentele de celule T CD4 și CD8 splenice și de celule B în grupurile de control și AME. Populația de celule T CD4(+) a crescut semnificativ de la 23,4 % la 27,2 % și 26,9 % în grupurile cu 500 și, respectiv, 2.500 mg/kg [figurile 6(a) și 6(d)]. Nu s-au observat diferențe în ceea ce privește populațiile de celule T CD8 și de celule B [figurile 6(a), 6(b) și 6(d)]. Moleculele MHC clasa II sunt necesare pentru prezentarea antigenelor la celulele T CD4. Am analizat expresia splenică a moleculelor MHC clasa II de șoarece IA/IE și am constatat că intensitatea medie de fluorescență a moleculelor MHC II a crescut semnificativ de la 65,3 la 68,9 în grupul cu 2 500 mg/kg AME [Figurile 6(c) și 6(e)]. Aceste constatări sugerează că AME induce modificări în sistemul imunitar adaptativ.

(a)

(b)

.
(c)

(d)

(e)

.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figura 6

Efectele administrării orale de AME asupra compoziției sistemului imunitar adaptativ din splină. Splenocitele au fost izolate de la grupurile de control sau de la grupurile AME și dublu colorate cu anticorp anti-CD4 conjugat cu FITC și anticorp anti-CD8 conjugat cu PE (a), anticorp anti-CD19 conjugat cu FITC (b) sau anticorp anti-MHC II conjugat cu FITC (c) și evaluate cu ajutorul citometriei în flux. (a-c) Sunt prezentate dot blots sau histograme reprezentative. (d-e) Barele reprezintă media±SEM (n=6). P <0,001 față de control.

3,6. Efectele administrării orale de AME asupra proliferării celulelor T și a răspunsului citokinelor Th1/Th2 în splenocite

Am investigat funcția celulelor T splenice în urma tratamentului cu AME. Splenocitele izolate din grupurile de control sau din grupurile AME au fost stimulate cu anticorp anti-CD3, un mitogen care activează întreaga populație de celule T, indiferent de specificitatea receptorului de antigen. Tratamentul cu anticorpul anti-CD3 timp de 48 h a crescut densitatea optică de 2,6 ori, măsurată prin testul MTS. Nu a existat nicio diferență în ceea ce privește proliferarea indusă de anticorpul anti-CD3 între grupurile de control și AME [figura 7(a)]. IFN-γ și IL-4 sunt citokine reprezentative pentru celulele Th1 și, respectiv, Th2. Am evaluat secreția de IFN-γ și IL-4 în splenocitele stimulate cu anticorp anti-CD3. O reducere semnificativă a secreției de IFN-γ a fost observată în grupul AME de 500 mg/kg, în timp ce secreția de IL-4 a fost semnificativ crescută în grupul de 2.500 mg/kg [figura 7(b)]. Deși nu s-a observat niciun efect dependent de doză, AME a avut tendința de a promova răspunsul Th2.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 7

Efecte ale AME asupra proliferării și secreției de citokine a celulelor T splenice activate. Splenocitele izolate din grupurile de control și AME au fost cultivate și stimulate cu anticorp anti-CD3 (2 μg/ml) timp de 48 h. (a) Răspunsul proliferativ al splenocitelor a fost determinat cu ajutorul testului MTS. (b) Secreția de citokine la 48 h de stimulare a fost măsurată prin ELISA. Barele reprezintă media±SEM (n=6). (-): fără anticorp anti-CD3, (+): tratament cu anticorp anti-CD3. # P <0,001 față de martor (-), P <0,05 față de martor (+).

4. Discuție

În medicina tradițională chineză, se așteaptă ca plantele care stimulează Qi să îmbunătățească sistemul imunitar. În acest studiu, ne-am concentrat în mod specific asupra răspunsurilor inflamatorii ale macrofagelor și celulelor T izolate de la șoareci cărora li s-a administrat AME pe cale orală.

Peritonita sterilă indusă de tioglicolat a fost introdusă pentru prima dată în 1964 de Gallily și colab. și de atunci a fost cea mai frecvent utilizată metodă pentru izolarea macrofagelor primare . În ziua 4 după injectarea intraperitoneală de tioglicolat, numărul total de celule din exudatul peritoneal crește de aproximativ 5 ori . Dintre aceste celule, macrofagele sunt tipul celular predominant, urmate de eozinofile . Sursa numărului crescut de macrofage peritoneale la șoarecii injectați cu tioglicolat este reprezentată de monocitele din sânge derivate din măduva osoasă . În timpul procesului de diferențiere a monocitelor în macrofage are loc o suprareglare a receptorilor scavenger. Receptorii Scavenger, un tip de receptori înnăscuți ai macrofagelor, sunt responsabili de fagocitoză și recunosc în mod specific liganzii polianionici . Am folosit CD11b și mai mulți markeri ai receptorilor scavenger pentru a identifica macrofagele derivate din monocite în celulele exsudatelor peritoneale și am constatat că populația de celule CD11b(+)SRA(+) a fost semnificativ crescută în grupul AME. Acest lucru sugerează că administrarea de AME promovează recrutarea și diferențierea monocitelor din sânge în macrofage ca răspuns la tioglicolat.

LPS este recunoscut de complexul receptor Toll-like (TLR)-4/MD-2. TLR4 induce răspunsuri inflamatorii prin intermediul a două molecule adaptoare, MyD88 și TRIF . Calea de semnalizare dependentă de MyD88 activează NF-κB și proteina kinaza activată de mitogen (MAPK) pentru a induce gene inflamatorii precum TNF-α și IL-6 . Calea de semnalizare dependentă de TRIF activează factorul de reglare a interferonului-3 pentru a produce IFN-β, care este necesar pentru amplificarea moleculelor costimulatoare . Calea de semnalizare TRIF participă, de asemenea, la activarea NF-κB și MAPK, dar într-un mod întârziat în raport cu calea dependentă de MyD88 . Upreglementarea moleculelor costimulatoare este exclusiv TRIF-dependentă, în timp ce răspunsurile inflamatorii sunt co-dependente de MyD88 și TRIF . Nu a existat niciun efect inhibitor asupra markerilor inflamatori testați în macrofagele din grupul AME. În schimb, expresia CD86 a fost diminuată. CD86 de pe macrofage se leagă de CD28 de pe celulele Th pentru a consolida activitatea celulelor Th . Rezultatele noastre indică faptul că administrarea orală de AME nu afectează răspunsurile inflamatorii dependente de NF-κB și MAPK în macrofage, dar interferează în mod specific cu calea dependentă de TRIF care duce doar la expresia CD86. Sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua dacă AME determină modificări într-o situație patologică în care predomină macrofagele și celulele Th.

Sistemul de macrofage stimulat cu LPS este un model in vitro foarte comun pentru evaluarea activității antiinflamatorii a produselor naturale sau a medicamentelor candidate. Utilizând acest model, este ușor de obținut rezultatul dorit cu componente solubile în lipide, deoarece acestea pot pătrunde cu ușurință în membrana celulară. Datele noastre au arătat că macrofagele peritoneale izolate de la șoareci cărora li s-a administrat AME pe cale orală nu au prezentat efecte antiinflamatorii ex vivo, ceea ce contrazice rezultatele raportate anterior in vitro . În schimb, activitatea antiinflamatorie a AME a fost observată în răspunsul seric al TNF-α și IL-6 la injectarea intraperitoneală de LPS. Această activitate antiinflamatorie sistemică este cel mai puțin probabil să fie mediată de modularea macrofagelor. Una dintre diferențele dintre condițiile in vivo și in vitro este că LPS este transportat în circulație de mai multe lipoproteine și apoi eliminat de hepatocite in vivo, în timp ce acest eveniment nu poate fi imitat in vitro . Eliminarea LPS poate preveni stimularea excesivă a macrofagelor hepatice . Rămâne de stabilit dacă activitatea antiinflamatorie sistemică a AME este legată de eliminarea LPS în ficat. Un rezultat similar a fost obținut la macrofagele peritoneale izolate de la șoareci cărora li s-a administrat pe cale orală extract de apă de Astragalus membranaceus (date nepublicate). Astragalus membranaceus și AM aparțin aceleiași categorii de plante care tonifiază Qi. În acest moment, nu știm dacă activitatea antiinflamatorie in vivo care nu implică modularea macrofagelor este unică pentru aceste plante medicinale sau este o proprietate comună care poate fi indusă de plantele medicinale care tonifiază Qi și trebuie să acumulăm mai multe date pentru a trage concluzii. În plus, Li et al. au raportat că atractylenolide I și 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, un tip de compus poliacetilenic izolat din AM, au o structură moleculară care interacționează cu receptorul glucocorticoid legat de membrană . Conform studiului lor, 300 mg/kg de atractylenolide I pe cale orală și 30 mg/kg de poliacetilenă pe cale orală au fost dozele minime necesare pentru a arăta efecte antiinflamatorii . Cantitatea de atractylenolide I din 2 500 mg/kg AME este de numai 0,097 mg/kg, o doză cu mult sub cea minimă necesară. Mai mult, trebuie să fi avut loc o pierdere de poliacetilene în timpul preparării AME. Este posibil ca AME să conțină compuși neidentificați asemănători glucocorticoizilor care contribuie la activitatea sa antiinflamatoare sistemică.

Este necesar un număr suficient de celule T pentru a menține un răspuns imunitar adecvat. În condiții normale, numărul total de celule T este menținut prin generarea de celule T naive în timus și prin reînnoirea celulelor T naive periferice și a celulelor T cu memorie. Șoarecii și oamenii suferă atrofierea timusului odată cu vârsta și, în consecință, producția de celule T naive scade la ambele specii. Cu toate acestea, în ceea ce privește menținerea celulelor T naive, șoarecii produc celule T naive în timpul vieții lor, în timp ce oamenii adulți mențin această populație prin diviziunea celulelor T naive periferice . În plus, durata de viață a celulelor T naive la șoareci este de 40 de ori mai scurtă decât cea a omologilor lor umani . Celulele T cu memorie sunt menținute prin diviziune intermitentă . Mecanismul precis de supraviețuire și de proliferare homeostatică a celulelor T naive și de memorie nu este complet definit, dar implică semnale de la complexul TCR/MHC și citokine precum IL-7 și IL-15 . Efectul prelungit al vaccinurilor depinde de celulele T cu memorie, în timp ce tratamentul afecțiunilor limfopenice necesită celule T naive. Nu am determinat dacă populația de celule T CD4 splenice care a crescut în urma tratamentului cu AME era formată din celule T CD4 naive sau din celule T CD4 de memorie. O caracterizare detaliată a fracțiunii celulare care răspunde la AME va ajuta la specificarea situației care este mai potrivită pentru aplicarea AME.

De remarcat, în grupul AME a avut loc o creștere concomitentă a moleculelor MHC clasa II în splină. Moleculele MHC clasa II sunt necesare pentru a furniza antigene celulelor T CD4. Am constatat în mod curent că majoritatea celulelor care exprimă MHC clasa II în splină sunt celule B, iar restul celulelor sunt macrofage și celule dendritice. Nu am clarificat ce tipuri de celule au prezentat o suprareglare a moleculelor MHC clasa II după administrarea de AME. Cu toate acestea, creșterea atât a numărului de celule T CD4, cât și a expresiei moleculei MHC clasa II în splină indică faptul că suplimentarea AME contribuie la menținerea sistemică a celulelor T CD4. Rolul IL-4 în condiții fiziologice este de a spori răspunsul anticorpilor prin promovarea supraviețuirii și proliferării celulelor B și de a asigura apărarea împotriva infecțiilor cu helminți . Splenocitele din grupurile AME au prezentat o producție crescută de IL-4 în timpul activării celulelor T ex vivo, concomitent cu o producție scăzută de IFN-γ. Aceste rezultate sugerează că, în condiții normale, AME promovează răspunsul Th2. În schimb, administrarea orală de glicoproteină derivată din AM promovează răspunsul Th1, în timp ce scade răspunsul Th2 într-un model alergic. Nu este clar dacă acest compus reprezintă întreaga activitate a AM. Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina dacă AM previne sau agravează răspunsurile Th2 patologice.

5. Concluzie

În acest studiu, am observat modificări ale răspunsurilor macrofagelor și celulelor T la șoarecii normali în urma administrării orale de AME. AME a îmbunătățit diferențierea monocitelor indusă de tioglicolat în peritoneu și a suprimat nivelurile de TNF-α și IL-6 induse de LPS în ser. Spre deosebire de aceste efecte antiinflamatorii sistemice, efectele antiinflamatorii nu au fost evidente în macrofagele izolate din grupul AME, cu excepția modificărilor în expresia moleculelor costimulatoare. AME a influențat, de asemenea, sistemul imunitar adaptativ prin creșterea numărului de celule T CD4 și a expresiei moleculelor MHC clasa II și prin promovarea răspunsului Th2 față de răspunsul Th1.

Abbreviații

AM:	Atractylodes macrocephala Koidz
AME:	AM extract de apă
LPS:	Lipopolizaharide
TNF-α:	Factorul de necroză tumorală-α
IL:	Interleukina
APC:	Celule prezentatoare de antigen
TCR:	Receptor al celulelor T
MHC:	Complexul major de histocompatibilitate
Celula T:
Celula T:	T helper cell
DW:	Apă deionizată
FBS:	Ser fetal bovin
PBS:	Salină tamponată cu fosfat
iNOS:	Sintetază de oxid nitric inductibilă
COX-2:	Ciclooxigenază-2
TLR:	Receptor asemănător cu molul
IFN-γ:	Interferon-γ
MAPK:	Proteina kinază activată de mitogen.

Date disponibile

Datele utilizate pentru a susține rezultatele acestui studiu sunt disponibile la cerere la autorul corespondent.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu au conflicte de interese.

Recunoștințe

Această cercetare a fost susținută de Programul de cercetare științifică de bază prin intermediul Fundației Naționale de Cercetare din Coreea, finanțat de Ministerul Educației (2014R1A1A2055052).

.