Aislamiento e identificación de volátiles
La nariz humana percibe muchos COVs como olores y estos olores son a menudo nuestra primera indicación de que hay mohos presentes. Sin embargo, la caracterización química (aislamiento, separación, identificación y cuantificación) de los COV requiere métodos analíticos especializados, distintos de los utilizados en la química «húmeda» tradicional. Los avances tecnológicos de finales del siglo XX y principios del XXI han mejorado nuestra capacidad para detectar volátiles de forma precisa, exacta y a bajas concentraciones (Zhang y Li, 2010; Hung et al., 2015). En resumen, los métodos tradicionales implican la destilación al vapor y la extracción líquido-líquido, seguidas de la concentración y la verificación química de los compuestos individuales. Algunos de los primeros estudios sobre la naturaleza química de los COV se realizaron utilizando extractos de cloruro de metileno que se concentraban mediante destilación al vapor y se analizaban mediante cromatografía de gases-líquidos y espectrometría de masas (EM). En un primer estudio en el que se utilizó este enfoque, se analizaron los COV de Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae y Aspergillus parasiticus. Las cuatro especies produjeron 3-metilbutanol, 3-octanona, 3-octanol, 1-octen-3-ol, 1-octenol y 2-octen-1-ol. En el caso de A. niger, más del 90% de la mezcla de COV identificada consistía en 1-octen-3-ol, que es el compuesto oloroso que da a los hongos su olor característico. En el caso de A. parasiticus, el 1-octen-3-ol constituía el 35,6% del total de la mezcla volátil, mientras que el compuesto relacionado de ocho carbonos, el 2-octen-1-ol, que tiene un desagradable olor a aceite de mostaza, constituía el 34,8% (Kamiński et al., 1974).
Desde entonces, los métodos se han basado en la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), que combina la separación cromatográfica, la identificación por el espectro de masas y la retención cromatográfica, y la cuantificación de muestras volátiles. Los COV presentes en el espacio de cabeza de los cultivos fúngicos suelen recogerse mediante materiales sólidos sorptivos, como el carbón activado o una fibra. Cada método de recogida tiene sesgos innatos y puede permitir la formación de artefactos; en general, los compuestos no polares se recogen preferentemente sobre los polares. La cromatografía de gases también puede introducir errores, ya que a veces es difícil separar dos compuestos entre sí, lo que da lugar a su confusión. Esto se ha observado en el caso del 2-metil-1-butanol y el 3-metil-1-butanol, isómeros que sólo difieren en la transposición de un grupo metilo (Börjesson et al., 1992). Otras desventajas del análisis por GC-MS son la necesidad de contar con operadores cualificados, su coste relativo y el hecho de que no es eficaz con los COV más reactivos (Elke et al., 1999; Gao et al., 2002; Gao y Martin, 2002; Rappert y Müller, 2005).
La microextracción en fase sólida (SPME) es un método popular y portátil. Los COV se absorben primero y se concentran en una fibra, y luego se llevan al detector donde se produce la desorción en el propio inyector de la GC. La SPME es muy adecuada para tomar muestras ambientales que luego se transportan al laboratorio para su identificación. Junto con la GC-MS, es un medio conveniente y ampliamente utilizado para identificar cualitativamente los COV de cultivos microbianos o de edificios contaminados (Fiedler et al., 2001; Wady et al., 2003; Jeleń y Grabarkiewicz-Szczesna, 2005). La SPME suele ser el mejor enfoque para determinar la cantidad relativa de un compuesto volátil objetivo en una situación exploratoria, o para procesos de muestreo repetitivos. Sin embargo, no es útil para la identificación de nuevos compuestos.
Se han desarrollado muchos métodos analíticos especializados que complementan los enfoques clásicos de GC-MS y pueden ser útiles para los análisis específicos. Por ejemplo, la reacción de transferencia de protones-espectrometría de masas (PTR-MS) es útil para tomar muestras rápidas y para detectar concentraciones bajas (Kamysek et al., 2011; Schwoebel et al., 2011). Este método se ha empleado en la ciencia medioambiental, la tecnología de los alimentos y el diagnóstico médico (Gasperi et al., 2001; Cappellin et al, 2013).
Usando desorción térmica (TD)-cromatografía de gases/espectroscopia de masas, se ha caracterizado el perfil de metabolitos volátiles in vitro de Aspergillus fumigatus indicando una firma distintiva que contiene los monoterpenos canfeno, α- y β-pineno, y limoneno; y los compuestos sesquiterpénicos α- y β-trans-bergamoteno (Koo et al., 2014).
La espectrometría de masas con tubo de flujo de iones seleccionados (SIFT-MS) tiene la capacidad de detectar COV microbianos con rapidez y sensibilidad en una mezcla de gases moderadamente compleja. Es capaz de detectar COV a bajas concentraciones de parte por billón y puede medir ciertos compuestos en el rango de parte por trillón. En esta técnica, los COV totales se ionizan dentro de un tubo de flujo, sin necesidad de separación cromatográfica (Syhre et al., 2008; Chambers et al., 2011). El método se ha utilizado para cuantificar los COVs emitidos por A. fumigatus en cocultivo con bacterias que suelen encontrarse en los pulmones humanos enfermos. Los cultivos con A. fumigatus produjeron cantidades «copiosas» de amoníaco y de los compuestos organoazufrados metanotiol (también conocido como metil mercaptano), dimetil sulfuro y dimetil disulfuro (Chippendale et al., 2014).
La extracción por destilación simultánea (SDE) incluye una fibra de sílice corta cubierta de material orgánico como fase estacionaria para concentrar los COV que luego se desorben en un inyector caliente. La SDE se ha utilizado para determinar los componentes volátiles en los análisis medioambientales, alimentarios, forenses, petroleros, farmacéuticos y de polímeros con el fin de obtener muestras más concentradas (Orav et al., 1996). Por ejemplo, se han estudiado ciertos compuestos de sabor utilizando una combinación de SDE y SPME. Los compuestos del sabor pueden analizarse cuantitativamente mediante SDE, mientras que la SPME se utiliza para un cribado sencillo, rápido y rutinario (Cai et al., 2001).
El espectrómetro de movilidad de iones en columna multicapilar (MCC-IMS) tiene una sensibilidad en el rango de la parte por billón, es de alta velocidad y requiere pocos conocimientos técnicos. Los metabolitos característicos de las especies A. fumigatus y Candida se han diferenciado en el análisis del espacio de la cabeza mediante este enfoque (Perl et al., 2011).
Las narices electrónicas (e-noses) traducen los volátiles en señales eléctricas basadas en la interacción con superficies electrónicas y pueden utilizarse para detectar compuestos conocidos. Las narices electrónicas están compuestas por un grupo de sensores químicos con diferentes selectividades, una unidad de preprocesamiento de señales y un sistema de distinción de patrones (Gardner y Bartlett, 1994). Los diferentes COVs forman una huella dactilar característica que puede distinguirse mediante comparaciones con patrones previamente registrados en el sistema de reconocimiento. La aplicación médica de las narices electrónicas se centró originalmente en patógenos bacterianos o en enfermedades no infecciosas como el cáncer de pulmón, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y el asma (Valera et al., 2012). Dependiendo de la aplicación, se utilizan muestras de COV de hisopos, esputo, suero, heces, aliento u orina con fines de diagnóstico. Las muestras de aliento se han utilizado para la detección precoz de la aspergilosis (de Heer et al., 2013).
Siguen existiendo muchos retos técnicos al trabajar con COVs fúngicos, y a menudo es difícil comparar los resultados obtenidos entre diferentes laboratorios. La misma especie fúngica puede tener diferentes perfiles de COV basados en factores ambientales y genéticos desconocidos o no controlados. Además, el protocolo experimental utilizado puede afectar drásticamente al perfil de COV. Por ejemplo, en un trabajo sobre Aspergillus flavus, de Lucca et al. (2010) detectaron sólo un terpeno utilizando SPME para recoger los volátiles antes de someterlos a GC-MS. Posteriormente, empleando un concentrador de muestras antes de someterlas a un modelo de instrumento GC-MS diferente, el grupo pudo discernir varios terpenos (de Lucca et al., 2012). El método de manipulación de los materiales antes de la experimentación puede dar lugar a artefactos y la esterilización en autoclave puede provocar la formación de volátiles no biogénicos (Börjesson et al., 1992). Dado que los datos son a menudo inconsistentes entre los ensayos, algunos autores han cuestionado la reproducibilidad de las emisiones microbianas de COV (Schleibinger et al., 2002). Los futuros trabajos con COVs fúngicos deben ser conscientes de los muchos factores que pueden influir en los resultados. Sería útil que la comunidad de científicos que estudian los COVs fúngicos desarrollara directrices sobre las mejores prácticas.