Nadando en un mar de células: ¿Por qué la genómica unicelular?
Los sistemas biológicos complejos son el resultado de la función coordinada de células individuales que ejecutan una intrincada «danza», cada una de las cuales contribuye con su propio papel especial al conjunto. Debido a esta complejidad, la investigación de la expresión génica en organismos, tejidos o poblaciones celulares suele estar limitada por el uso de métodos tradicionales de RNA-seq a granel. Como científicos, entendemos intuitivamente que cuando «trituramos y encontramos» para realizar experimentos en nuestra mezcla diluida de ARN, en realidad sólo estamos obteniendo una pequeña idea de lo que podría estar ocurriendo en nuestras células de interés: se pierden las diferencias entre células y la heterogeneidad celular puede quedar completamente enmascarada. De hecho, el análisis de la expresión de ARN a granel a menudo describe un estado inferido en el que ninguna (o muy pocas) de las células existen realmente!
Tal vez usted es un neurocientífico que trabaja en el cerebro de un ratón y estudia el desarrollo de una subpoblación de neuronas que producen un neurotransmisor específico. Si pudiera aislar esa población y analizarla célula por célula, los conocimientos potenciales serían, efectivamente, estimulantes para las neuronas. Lo mismo ocurre en el caso de la investigación sobre el cáncer: ¿cuál es la mejor manera de separar la expresión de los genes y, tal vez más importante, la heterogeneidad celular, en un tumor? ¿Y si se pudieran comparar no sólo las diferencias inter-tumorales, sino también las intra-tumorales, y explorar las poblaciones de células inmunes relacionadas con el microambiente tumoral? Esta diversidad, a menudo oscurecida por los métodos de ARN-seq a granel, puede revelarse mediante el uso de ARN-seq de células individuales para explorar específicamente estas poblaciones de células clínicamente significativas. Los ejemplos de los inconvenientes del análisis a granel son abundantes, y la disección de las diferencias de los tipos de células en la mayoría, si no en todos, de estos complejos sistemas biológicos es fundamental para nuestra comprensión de sus contribuciones, especialmente durante el desarrollo y en la progresión de la enfermedad.
¿Cómo aislamos y analizamos las células individuales?
La tecnología de ARN-seq de células individuales (scRNA-seq) de 10x Genomics, la solución Chromium™ Single Cell 3′, permite analizar los transcriptomas célula a célula mediante el uso de partición microfluídica para capturar células individuales y preparar bibliotecas de ADNc de secuenciación de próxima generación (NGS) con código de barras. En concreto, las células individuales, los reactivos de transcripción inversa (RT), las perlas de gel que contienen oligonucleótidos con código de barras y el aceite se combinan en un chip de microfluidos para formar vesículas de reacción denominadas perlas de gel en emulsión o GEM. Las GEMs se forman en paralelo dentro de los canales microfluídicos del chip, lo que permite al usuario procesar de 100 a 10.000 células individuales en una sola corrida de 7 minutos del instrumento Chromium™. Es importante tener en cuenta que las células se cargan a una dilución límite con el fin de maximizar el número de GEMs que contienen una sola célula para asegurar una baja tasa de dobletes, manteniendo al mismo tiempo una alta tasa de recuperación de células de hasta ~65%.
Cada GEM funcional contiene una sola célula, una sola perla de gel y reactivos RT. Dentro de cada vesícula de reacción del GEM, se lisó una sola célula, se disolvió la perla de gel para liberar los oligonucleótidos RT con código de barras idéntico en la solución, y se produjo la transcripción inversa del ARNm poliadenilado. Como resultado, todos los cDNAs de una sola célula tendrán el mismo código de barras, permitiendo que las lecturas de secuenciación sean mapeadas de vuelta a sus células individuales originales de origen. La preparación de bibliotecas NGS a partir de estos ADNc con código de barras se lleva a cabo en una reacción masiva de gran eficacia. El siguiente vídeo ofrece una excelente explicación visual de cómo funciona todo esto.
Desde la preparación de muestras hasta los vídeos de instrucciones: Enlaces útiles para empezar
El flujo de trabajo de Chromium Single Cell 3′ comienza con sus células de interés seguido de la construcción de la biblioteca NGS utilizando nuestros kits de reactivos y el Chromium Controller. La preparación de su biblioteca de ADNc con código de barras (tal y como se describe en el vídeo anterior) es un paso importante y, de acuerdo con el dicho «basura que entra, basura que sale», la preparación de suspensiones celulares de alta calidad es clave para sacar el máximo partido a sus datos de ARN-seq. Si necesita ayuda con el proceso de preparación de las células, tenemos múltiples protocolos disponibles en nuestro sitio web, como la disociación del tejido neural o la preparación de suspensiones de protoplastos de musgo para su uso en scRNA-seq, con más protocolos que se añaden regularmente en nuestro sitio web de apoyo. Para obtener orientación y recomendaciones sobre la mejor manera de preparar sus muestras una vez que están en suspensión, un buen punto de partida es nuestra guía de preparación de células individuales, donde puede aprender más sobre las mejores prácticas y ver un protocolo general. Si le gusta más aprender de forma visual, nuestros vídeos explicativos, especialmente los capítulos 4 a 7, le ayudarán a recorrer el proceso de preparación de muestras y bibliotecas.
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Guía de preparación de células individuales
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Protocolos demostrados
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Cómo…Cómo
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Controlador Chromium™
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Guías de usuario
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Cómoto-videos
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Software Cell Ranger™
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Loupe™ Cell Browser
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How-to-videos
Analizando sus datos, una célula a la vez
Una vez preparada su biblioteca, se realiza la secuenciación mediante los instrumentos de secuenciación Illumina®. Esto nos lleva a la parte divertida: ¡obtener información biológica de sus datos de ARN-seq unicelulares! La (potencialmente) enorme cantidad de datos que genera la solución Chromium Single Cell 3′ puede ser fácilmente manejada por nuestro software y herramientas de visualización que fueron diseñadas para eliminar gran parte de las conjeturas: el software Cell Ranger™ transforma los datos de secuenciación con código de barras en archivos listos para el análisis de expresión de células individuales, y la visualización se realiza a través del Loupe™ Cell Browser. Si desea un tutorial paso a paso sobre el uso de nuestro software, los capítulos 8 a 11 de nuestros videos de cómo hacerlo cubren todo, desde el recuento de transcripciones con el software Cell Ranger hasta la hermosa visualización de datos con Loupe Cell Browser. También hay un número creciente de herramientas de análisis de células individuales desarrolladas por la comunidad, incluyendo Seurat, Monocle y Cell View. Lea más sobre estas herramientas de análisis y otros artículos sobre células individuales en el Blog de 10x Genomics, donde destacamos importantes contribuciones de investigación, proporcionamos consejos y trucos, y le mantenemos al día sobre todo lo relacionado con las células individuales.
Si tiene alguna otra pregunta o inquietud sobre cómo empezar con la solución Chromium Single Cell 3′, no dude en dejar un comentario aquí o ponerse en contacto con nosotros directamente. Ya sea el seguimiento del desarrollo de organoides cerebrales, el estudio del trasplante de médula ósea en pacientes con leucemia mieloide aguda o el descubrimiento de una nueva vía de autorrenovación de las células madre intestinales, el número de publicaciones de Chromium Single Cell crece cada día, y estamos deseando conocer todas sus increíbles investigaciones.