Introducción
Hay aproximadamente 10.000 especies de microbios con nombre. Se estima que hay entre 10.000 y 100.000 especies más sin identificar por cada una identificada. No sólo hay muchos tipos de bacterias, sino que hay muchas bacterias individuales. Una sola cucharada de tierra puede tener 100 millones de bacterias individuales. Un raspado de las encías puede producir 1 millón de bacterias por cm2 (un cm2 es aproximadamente el tamaño de la uña del dedo meñique). Las bacterias que hay dentro y fuera de nuestro cuerpo constituyen aproximadamente el 10% de nuestro peso corporal seco.
La mayoría de las especies de bacterias que se conocen en la actualidad se han identificado mediante técnicas microbiológicas tradicionales, como la reacción de tinción de Gram, la morfología y las reacciones metabólicas. Las bacterias rara vez viven solas, sino en comunidades con otras bacterias. Esto es cierto tanto en el medio ambiente como en nuestro cuerpo. Esta clase se centra en el papel de las bacterias en las enfermedades. Aislar una sola especie de bacteria es el primer paso para identificar las bacterias posiblemente responsables de un proceso de enfermedad.
El primer requisito para aislar físicamente una bacteria es que se pueda cultivar en el laboratorio. Esto requiere conocer la temperatura óptima para el crecimiento, los requisitos óptimos de oxígeno y las necesidades nutricionales óptimas. En este curso trabajamos con un número muy limitado de bacterias. Las bacterias con las que trabajamos también son muy fáciles de cultivar en el laboratorio. La mayoría de las bacterias no son tan agradables.
Hay dos formas principales de aislar organismos.
- El método de aislamiento en placa de agar
- El método de placa de vertido
El aislamiento en placa de agar implica la dilución sucesiva de organismos hasta que se tengan las células a una densidad lo suficientemente baja como para que las células individuales estén físicamente aisladas espacialmente para dar lugar a colonias individuales reconocibles. En el método de la placa de vertido, se diluye la muestra lo suficiente antes de añadirla al agar fundido enfriado y luego se vierte esta mezcla en un plato. Las células aisladas dan lugar a colonias individuales que crecen en el propio agar. Esta técnica puede ser un poco complicada. Si el agar fundido está demasiado caliente, se matan todas las bacterias. Si el agar fundido está demasiado frío, acabas con un gran bulto en tu placa de Petri. El método de las estrías produce colonias individuales en la superficie del agar. Esta técnica es mucho más rápida y fácil de dominar.
Resumen
Se le entregará una muestra de caldo que contiene tres organismos, Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens y Escherichia. coli.
Los tres organismos crecen fácilmente de forma aeróbica en agar triptico de soja (TSA). Sin embargo, S. marsescens sólo forma un pigmento rojo a 35°C o menos y de forma óptima a temperatura ambiente (25°C). Crece muy rápidamente a todas las temperaturas formando colonias de tamaño medio.
E. coli tiene un aspecto bronceado a todas las temperaturas y también es de crecimiento rápido que forma colonias grandes.
S. xylosus tiene un aspecto amarillo anaranjado a todas las temperaturas, crece rápidamente y forma colonias de tamaño medio a grande.
Su capacidad para aislar y ver los tres organismos en su placa depende de las condiciones de incubación adecuadas. Sus placas se incubarán a temperatura ambiente durante 48 horas. Deberá ser capaz de identificar los tres organismos basándose en el tamaño de la colonia y el pigmento.
Materiales
- 1 cultivo mixto en tubo de caldo de soja tríptico (TSB) que contiene Staphylococcus xylosus, Serratia marsescens y Escherichia. Coli (todos BSL2)
- 3 placas de TSA
Procedimiento de rayado para el aislamiento
Hay varios métodos de rayado para el aislamiento. La gran mayoría de nuestros estudiantes han tenido mucho éxito con el método de rayado por cuadrantes que se describe a continuación.
- Etiqueta tu placa con tu nombre, fecha, sección y organismo.
- Usa los procedimientos BSL2 para obtener un bucle lleno de organismos de tu tubo de caldo de soja tríptico (TSB). Consulte el protocolo de técnica aséptica.
- Asegúrese de haber mezclado adecuadamente su tubo de caldo para que los organismos queden suspendidos uniformemente en el caldo.
- Vuelva a tapar su tubo de TSB.
- Puede hacer la siguiente parte con su placa en la mesa de laboratorio o sosteniéndola en la mano. Tú decides qué funciona mejor. Arrastre ligeramente su lazo de un lado a otro de la superficie del agar. (Consulte la figura 1.)
- Cuanto más arrastre, más bacterias depositará.
- La idea general es disminuir la concentración de bacterias con cada pasada.
- De cuatro a cinco zigzags parece funcionar bien.
- Experimente con sus diferentes placas. Asegúrese de llevar un registro de lo que hizo en cada placa.
- Si está utilizando un incinerador, esterilice su bucle. Si está utilizando bucles de plástico, deseche su bucle usado en el contenedor de cavidades y obtenga un nuevo bucle de plástico estéril.
- No vuelva a entrar en el tubo de caldo original.
- Toque su bucle en la superficie del agar contra el extremo más alejado de su primera raya. Repita arrastrando hacia adelante y hacia atrás.
- o No arrastre hacia el centro de su placa.
- o Debería poder ver las débiles hendiduras de su línea de rayado en la superficie del agar.
- Usando un bucle estéril, repita el procedimiento en su segundo rayado.
- Usando un bucle estéril, repita el procedimiento en su tercer rayado. Zigzaguee la última parte en el centro de la placa.
- Debería terminar con colonias aisladas en alguna parte de su última racha.
- Si está utilizando un incinerador, esterilice su bucle. Si utiliza bucles de plástico, deseche su bucle usado en el contenedor de cavicidas.
- Coloque la tapa en su placa.
- Coloque sus placas completadas con el lado del agar hacia arriba en la rejilla de incubación en el escritorio frontal en la sección de incubación.
Figura 1: Método de rayado por cuadrantes para el aislamiento.
Notas
- Es absolutamente esencial que esterilice su bucle entre cada rayado, ya sea utilizando el incinerador u obteniendo un nuevo bucle de plástico estéril. Este es el error más común que cometen los estudiantes.
- No deje su placa abierta demasiado tiempo o las bacterias adicionales del entorno caerán en su placa.
- No se desilusione si no obtiene colonias aisladas en su primer intento. Este es un procedimiento difícil.