Análisis y cuantificación de la fusión de mioblastos in vitro mediante la tinción múltiple de LADD

El tejido muscular esquelético adulto contiene una población de células precursoras, conocidas como células satélite, que son responsables de la reparación del músculo esquelético (1-3). Las células satélite activadas (mioblastos) migran al lugar del traumatismo muscular, donde proliferan, se diferencian y se fusionan en miotubos multinucleados (3-5). El éxito final de este proceso se mide por el grado en que los mioblastos residentes se han fusionado durante la diferenciación terminal.

Para evaluar experimentalmente la fusión de mioblastos in vitro, se calcula un índice de fusión basado en la detección de inmunofluorescencia por microscopía. Se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia para detectar las proteínas estructurales de las fibras musculares, como la cadena pesada de la miosina (MyHC) y la desmina, o bien se puede utilizar faloidina marcada con fluorescencia para visualizar la F-actina (6-9). Los núcleos se marcan con fluorescencia utilizando un compuesto de unión al ADN como Hoechst 33258. Posteriormente, se calcula el porcentaje de núcleos en miocitos con núcleos ≤3 (9) o el porcentaje de núcleos en miotubos MyHC-positivos (10). Estos enfoques están bien establecidos; sin embargo, requieren una optimización extensa y que requiere mucho tiempo para generar una señal fuerte y específica para el antígeno de interés y el posterior análisis de fusión. Si se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia, el acceso a un microscopio de fluorescencia es un requisito adicional que no está disponible en todas las instituciones. La cuantificación posterior requiere un análisis laborioso y largo de numerosos campos de visión para obtener un índice de fusión representativo de la población. Estas limitaciones, junto con el gasto relativo de los ensayos basados en anticuerpos, nos impulsaron a desarrollar un ensayo in vitro rápido y rentable para la cuantificación de la fusión de mioblastos utilizando la tinción múltiple de LADD, ampliamente disponible.

La tinción múltiple de LADD (11) es una tinción nuclear y citoplasmática combinada que contiene fucsina y azul de toluidina (Cat. #70955; LADD Research Industries, Williston, VT). Para nuestros estudios, el LADD fresco se prepara para contener 0,365 g de azul de toluidina (Cat. #89640-5G; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 0,135 g de fucsina (Cat. #47860-25G; Sigma- Aldrich) en un volumen final de 50 ml de etanol al 30%. La solución se mezcla hasta que se disuelve y luego se filtra a través de papel de filtro Whatman (número 4) (Cat. #09-825B, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). La tinción de LADD puede almacenarse en un recipiente de plástico o de vidrio a temperatura ambiente y puede reutilizarse. Las células que se van a teñir se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijan en etanol al 70% durante 10 minutos. Se retira el etanol y se añaden 500 µl de tinción LADD, asegurando la cobertura total de las células. Las células se incuban durante 1 minuto, después de lo cual se retira la tinción, y las células se lavan repetidamente con agua destilada hasta que el LADD deja de filtrarse en el agua. A continuación, las células se dejan secar y se almacenan a temperatura ambiente hasta su visualización mediante microscopía de luz de contraste de fase. Para mejorar la iluminación durante la visualización, las células teñidas pueden sumergirse en PBS.

Para determinar si esta tinción puede utilizarse con éxito para visualizar la fusión de mioblastos, se cultivaron células C2C12 hasta el 80% de confluencia (Figura 1A) en condiciones de cultivo estándar (12). A continuación, se cambió el medio a un medio de diferenciación que contenía un 2% de suero de caballo, lo que dio lugar a la fusión en miotubos (Figura 1B). El éxito de la diferenciación se confirmó por el aumento de la expresión de MyHC (Figura 1D) en comparación con las células indiferenciadas (Figura 1C). Tras la tinción con LADD, los mioblastos C2C12 indiferenciados muestran un citoplasma púrpura claro y un núcleo más oscuro (Figura 1E; flecha). Sin embargo, tras la diferenciación, el citoplasma de los mioblastos aparece de color púrpura oscuro (Figura 1F; puntas de flecha), mientras que los núcleos más claros son claramente visibles dentro de la célula multinucleada (Figura 1F; flecha). Por lo tanto, tras la tinción múltiple de LADD, se observan núcleos claramente definidos que se distinguen tan fácilmente del citoplasma del miotubo multinucleado (Figura 1F) como se observa mediante microscopía de fluorescencia tras la inmunocitoquímica (Figura 1D).

Para determinar si el análisis de imágenes podía utilizarse para medir el progreso de la fusión de mioblastos, se diferenciaron células C2C12 durante 6 días y se tomaron imágenes de las células teñidas con LADD con un aumento de 200× utilizando un microscopio de luz invertido Olympus CKX41 (Olympus Corporation, Tokio, Japón). Como se esperaba, el número de miocitos y miotubos en fusión aumentó claramente en cada día de diferenciación posterior (Figura 2A). A continuación, se calculó un índice de fusión, y se observó que los mioblastos diferenciados aumentaban progresivamente su índice de fusión desde el 0,45% (día 1) hasta el 31,4% (día 6) (figura 2B). El índice de fusión derivado de este modo se compara favorablemente con el índice calculado mediante inmunocitoquímica estándar (para detectar MyHC) y tinción nuclear (13). Para determinar si el software de análisis ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) podría adaptarse para cuantificar el área de las miofibras (como medida de fusión), se desarrolló una macro y se probó en las imágenes representadas por la Figura 2A. La macro se configura como sigue y luego se guarda:

• Abra ImageJ y haga clic en «Plugins = > Macros = > Macros de inicio»

• Sustituya el texto existente por la codificación que se muestra en la Tabla suplementaria S1.

Las imágenes se abren en ImageJ, y la macro se ejecuta haciendo clic en «Macros = > Run Macro». Esto analizará las imágenes de una en una. El usuario debe confirmar que el umbral se ha establecido correctamente; sólo el área de miofibras debe ser analizado. El umbral de color puede cambiarse editando la línea de la macro «setThreshold(0,130)»; aumentando el segundo número, se incluirán más áreas ligeramente teñidas, mientras que se excluyen más áreas cuando se reduce este número. Utilizando este método, el área de miofibras alcanzó el 29,6% en el Día 6 (Figura 2C), comparándose bien con el índice de fusión calculado para el mismo punto temporal (Figura 2B). Jenner y Giemsa tintes también se puede utilizar para teñir miotubos para microscopía de luz en gran medida de la misma manera que LADD, sin embargo, la tinción con LADD es muchas veces más rápido, y la macro ImageJ desarrollamos permite un mayor control sobre las áreas que se miden (14).

Para validar aún más el uso de la tinción múltiple con LADD para el análisis de la fusión, se diferenciaron células C2C12 durante 5 días en presencia o ausencia de 10 µM de BB94 (Cat. #ab142087; Abcam, Cambridge, UK) y posteriormente se fijaron y tiñeron con LADD como se ha descrito anteriormente. El BB94 es un inhibidor sintético de la metaloproteasa de la matriz, disponible en el mercado, que ha demostrado previamente que reduce la fusión de mioblastos (15,16). En presencia de BB94, el índice de fusión disminuyó significativamente del 50% (control DMSO) al 22% (P < 0,05) (Figura 2D); el análisis del área de miofibras reveló la misma tendencia, con una fusión reducida del 46% (control DMSO) al 21% (P < 0.05) en presencia de BB94 (Figura 2E).

Aquí presentamos un método rápido y novedoso para teñir tanto la estructura de las miofibras como los mionúcleos asociados utilizando la tinción múltiple LADD. ImageJ se utiliza posteriormente para evaluar con precisión el área de la fibra muscular como una medida de la fusión. El costo relativamente bajo de LADD y el tiempo muy reducido requerido para el procesamiento y el análisis significa que la fusión ahora puede ser analizada rápidamente en un laboratorio estándar sin la necesidad de inmunocitoquímica y microscopía de fluorescencia.