Biotinilación eficiente y purificación en un solo paso de factores de transcripción marcados en células de mamífero y ratones transgénicos

Resultados

Biotinilación eficiente de GATA-1 marcado en células transfectadas. El esquema para la biotinilación específica in vivo de proteínas marcadas en células de mamífero se describe en la Fig. 1A. Según este procedimiento, se fusiona un pequeño péptido (23 aa) con la proteína de interés y se coexpresa en células junto con BirA, una proteína-biotina ligasa bacteriana (20). La etiqueta peptídica utilizada ha sido aislada previamente a partir de una biblioteca de péptidos sintéticos que ha sido seleccionada para la biotinilación mediada por BirA, que se produce específicamente en el residuo de lisina de la etiqueta (16). Las búsquedas en bases de datos de proteínas no han identificado ninguna proteína natural que posea un motivo de secuencia similar al de la etiqueta peptídica.

La proteína que marcamos para probar este sistema fue el factor de transcripción hematopoyético murino esencial GATA-1 (para una revisión, véase la ref. 25). La etiqueta se fusionó N-terminal a GATA-1 y se expresó bajo el control de un casete de expresión de β-globina humana en células MEL, que pueden ser inducidas a sufrir una diferenciación celular eritroide terminal (22). También se clonó BirA y se expresó en células MEL utilizando el casete de expresión de globina humana. Se aislaron clones correspondientes a transfectantes estables simples y dobles para GATA-1 y BirA etiquetados, y se examinó inicialmente la expresión de ambas construcciones. En el caso de GATA-1, el análisis de Western blot utilizando un anticuerpo GATA-1 detecta la proteína marcada de migración más lenta así como el GATA-1 endógeno en los extractos nucleares de las células transfectadas (Fig. 1B, carriles 1 y 2). Se analizó la expresión de BirA a nivel de ARN (datos no mostrados).

A continuación comprobamos, en transfectantes estables seleccionados, si la proteína GATA-1 marcada era biotinilada por BirA. El análisis de extractos nucleares de clones de células MEL utilizando un conjugado de estreptavidina-HRP mostró una señal robusta correspondiente a la proteína GATA-1 marcada, detectable sólo en el carril del transfectante doble GATA-1/BirA marcado (Fig. 1B, carril 5). La biotinilación de la proteína GATA-1 marcada no es visible en ausencia de BirA (Fig. 1B, carril 6). Estos resultados confirman que la proteína BirA se sintetiza en forma activa en las células MEL transfectadas. Además, se observa muy poca biotinilación inespecífica de fondo en los extractos nucleares de las células MEL que expresan sólo BirA (Fig. 1B, carril 7). Por lo tanto, concluimos que la expresión de la proteína-biotina ligasa BirA bacteriana en células MEL puede biotinilar específicamente un factor de transcripción de mamífero que lleva una etiqueta peptídica única.

A continuación comprobamos la eficiencia de la biotinilación uniendo el GATA-1 marcado en extractos nucleares crudos a Dynabeads paramagnéticas de estreptavidina (Fig. 1C). El análisis del material eluido de las microesferas mostró que casi toda la proteína GATA-1 marcada estaba unida (comparar el carril 2 con los carriles 1 y 3, Fig. 1C). La repetición del mismo filtro con estreptavidina-HRP muestra una eficiencia de ≈100% en la biotinilación y captura de la GATA-1 marcada por las perlas (Fig. 1C, carriles 4 y 5). Además, en consonancia con lo observado en la Fig. 1B, hay poca unión de fondo de las proteínas biotiniladas endógenamente a las perlas, como se detecta por estreptavidina-HRP (Fig. 1C, carril 5). Estos datos demuestran que el GATA-1 marcado es biotinilado muy eficientemente y recuperado de los extractos mediante la unión de estreptavidina, con una biotinilación de fondo insignificante.

Purificación en un solo paso del GATA-1 biotinilado de extractos nucleares crudos mediante la unión de estreptavidina. También exploramos la viabilidad de una purificación de un solo paso para aislar GATA-1 biotinilado a partir de extractos nucleares crudos mediante la unión directa a perlas de estreptavidina bajo una rigurosidad moderada (150 mM NaCl/0,3% Nonidet P-40/200 ng/μl de albúmina de suero de pollo). Primero probamos una unión de control a partir de 5 mg de extractos nucleares crudos de células MEL que sólo expresaban BirA (Fig. 2, carril 4). El material eluido consistía en aproximadamente cinco bandas fuertemente teñidas contra un fondo de bandas mucho más débiles (Fig. 2, carril 5). Identificamos las proteínas de unión al fondo extirpando todo el carril del gel y analizándolo por cromatografía líquida-EM en tándem. Las proteínas así identificadas se clasifican en la Tabla 1 según la función biológica y el compartimento celular, tal y como lo define el Consorcio de Ontología Genética (www.geneontology.org). Los resultados mostraron que las proteínas de fondo más abundantes identificadas fueron las carboxilasas naturalmente biotiniladas y las enzimas asociadas, que coincidían en gran medida con las bandas de tinción intensa. También encontramos la unión de fondo de abundantes proteínas nucleares implicadas en el procesamiento del ARNm, como los factores de splicing, así como de proteínas ribosomales. En conjunto, estas tres clases de proteínas representaron >80% de la unión de fondo en las condiciones utilizadas (Tabla 1). Cabe destacar que se identificaron muy pocos péptidos correspondientes a factores implicados en la regulación transcripcional (Tabla 1). Concluimos que la unión de fondo a las perlas de estreptavidina se debe principalmente a proteínas endógenas biotiniladas, así como a abundantes factores nucleares implicados en el procesamiento del ARNm y en la síntesis y ensamblaje de ribosomas, con muy poca unión inespecífica de factores implicados en la regulación/activación transcripcional.

A continuación probamos a unir una cantidad similar de extracto nuclear crudo (5 mg) de transfectantes dobles de GATA-1/BirA marcados, en las mismas condiciones (Fig. 2, carril 2). El patrón de tinción del carril con el material eluido (Fig. 2, carril 3) fue significativamente diferente al observado con la unión de fondo en el carril 5, lo que indica un enriquecimiento significativo en las proteínas que coeluyen con el GATA-1 marcado (Fig. 2, carril 3 vs. carril 5). El GATA-1 biotinilado y las proteínas coeluyentes pueden diluirse o competir por la unión con las proteínas no específicas observadas en el carril 5. El enriquecimiento proteico visible en el carril 3 podría corresponder a proteínas copurificadas que interactúan con GATA-1. En el material eluido, también observamos una banda fuertemente teñida que migraba con un tamaño similar al esperado para el GATA-1 marcado (Fig. 2, flecha, carril 3). Confirmamos la presencia de GATA-1 en esta banda mediante la escisión del gel y la EM. El análisis detallado de todas las proteínas que se copurifican con el GATA-1 marcado se publicará en otro lugar (P.R., F.G. y J.S., resultados no publicados). En conjunto, estos datos demuestran la biotinilación cuantitativa del GATA-1 marcado en células MEL y su purificación eficiente a partir de extractos de proteínas crudas en un procedimiento de un solo paso mediante la unión directa a perlas de estreptavidina, con pocas bandas de unión de fondo que corresponden principalmente a proteínas biotiniladas endógenamente y a abundantes proteínas nucleares/nucleares fácilmente identificables.

La biotinilación no afecta a las propiedades de interacción con proteínas o de unión al ADN del GATA-1. Dado que es posible que la adición de la etiqueta peptídica y/o la biotinilación pueda afectar a las propiedades de la proteína marcada, probamos si el GATA-1 biotinilado podía seguir sufriendo interacciones proteína-proteína con un socio conocido de GATA-1, como el FOG-1 (26), y si podía unirse in vivo a objetivos génicos conocidos de GATA-1, como el promotor de globina βmaj de ratón. Llevamos a cabo un experimento de pull-down de GATA-1 biotinilado mediante la unión de extractos nucleares a perlas de estreptavidina y comprobamos si FOG-1 también se copurificaba. Encontramos que FOG-1 era arrastrado desde los extractos que expresaban GATA-1 biotinilado pero no desde los extractos que expresaban BirA solamente (Fig. 3A, carriles 2 y 4). También hemos encontrado que FOG-1 se copurifica con GATA-1 biotinilado por MS. También llevamos a cabo un experimento de pull-down de cromatina (ChIP) en el que la cromatina sonicada de células MEL reticuladas con formaldehído se incubó con perlas de estreptavidina, seguido de la elución del material unido y la recuperación del ADN pull-down. Utilizando cebadores específicos para el promotor βmaj, encontramos un enriquecimiento para estas secuencias en el ADN extraído de la cromatina de las células que expresan GATA-1 biotinilado pero no de las células que expresan BirA (Fig. 3B). También hemos encontrado que la biotinilación no afecta a la distribución subnuclear normalmente observada con el GATA-1 (Fig. 5, que se publica como información de apoyo en la página web de PNAS; ref. 27) y que el GATA-1 biotinilado muestra un perfil de fraccionamiento bioquímico idéntico al del GATA-1 endógeno en extractos nucleares de células MEL (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que las propiedades de GATA-1 no se ven afectadas por el marcado de biotinilación. Además, estos datos también demuestran la aplicación del marcaje por biotinilación como alternativa a los anticuerpos en métodos que implican un paso de purificación por afinidad, como los pull-downs de proteínas o un ensayo ChIP.

Etiquetado de biotinilación en ratones transgénicos. La capacidad de aislar directamente la proteína marcada con biotina a partir de extractos crudos en un solo paso plantea la perspectiva de utilizar este enfoque en la purificación de proteínas marcadas a partir de fuentes limitantes como los tejidos de ratón. Por lo tanto, probamos si el etiquetado por biotinilación mediado por BirA también funcionaría in vivo en ratones transgénicos. Dado que la sobreexpresión de GATA-1 conduce a la letalidad embrionaria en ratones (28), probamos este enfoque marcando el factor de transcripción eritropoyético esencial EKLF (29). El ADNc de EKLF de ratón se marcó con la etiqueta de biotinilación y un epítopo doble de hemaglutinina y se microinyectó en huevos de ratón para establecer líneas de ratones transgénicos. Del mismo modo, también se establecieron líneas de ratones transgénicos mediante la microinyección del constructo de cassette de expresión BirA/eritroide. Se seleccionaron y cruzaron líneas de ratones transgénicos con expresión detectable de EKLF y BirA marcados en células eritroides. Se evaluó la biotinilación in vivo del EKLF marcado en extractos nucleares preparados a partir de hígados fetales de embriones de 13,5 días postcoitum. El análisis de Western blot con un anticuerpo anti-EKLF detectó el EKLF endógeno así como el EKLF marcado, que se visualizó como un doblete (Fig. 4, carril 1). La unión de los extractos nucleares de hígado fetal a las perlas de estreptavidina muestra que sólo se retiene la banda superior del doblete, lo que sugiere que está biotinilada (Fig. 4, carriles 2 y 3). Esta observación se confirma al sondear el mismo blot con estreptavidina-HRP, que detecta una sola banda (Fig. 4, carriles 7 y 9). El doblete detectado por el anticuerpo EKLF se debe probablemente a la utilización diferencial de los codones de iniciación de la traducción en la etiqueta de biotinilación fusionada N-terminal (banda superior) y en el doble epítopo de hemaglutinina presente inmediatamente después, que también contiene un codón de iniciación (banda inferior). Como resultado, sólo la banda superior con la etiqueta de biotinilación sirve como sustrato para BirA, lo que demuestra aún más la especificidad in vivo de este enfoque. La unión de extractos nucleares a perlas de estreptavidina también demostró que una proporción significativa (≈50%) del EKLF marcado es biotinilado en los hígados fetales de los ratones transgénicos. Especulamos que la diferencia en las eficiencias de biotinilación entre las células transfectadas y los hígados fetales (aparte del uso de diferentes proteínas de fusión) puede reflejar una limitación in vivo en la disponibilidad de biotina (la biotina es abundante en el FCS utilizado para complementar los medios de cultivo celular) o una diferencia en los niveles de expresión de BirA. Estos resultados demuestran que la biotinilación específica de EKLF marcado por BirA bacteriana también puede lograrse con alta eficiencia in vivo en ratones transgénicos.