Centrifugación diferencial cinéticamente limitada como alternativa económica y fácilmente disponible a la elutriación centrífuga

En muchas aplicaciones, se desea separar las células objetivo de mezclas que contienen otras células con densidades similares, pero con tamaños diferentes (ya sea ligera o sustancialmente). Algunos ejemplos son la generación de cultivos celulares sincronizados en los que se aíslan las células en una fase concreta de su ciclo (caracterizada por su tamaño) (1-2), el aislamiento de corticótropos de otras células hipofisarias (3) y la clasificación de varias subpoblaciones de monocitos (4). El método de elección para separar poblaciones celulares basándose en las diferencias de velocidad de sedimentación (especialmente cuando las diferencias de densidad no son significativas) es un proceso llamado elutriación centrífuga (5). En este caso, los separandos (normalmente células) se someten a dos fuerzas: (i) una fuerza centrífuga que les hace sedimentar con una velocidad que es función de su densidad y tamaño, y (ii) un flujo convectivo en dirección opuesta que imparte una velocidad fija a todas las células. El flujo y/o la velocidad de centrifugación pueden ajustarse para recoger sólo las células cuya velocidad de sedimentación esté dentro de un rango determinado. Aunque este proceso también se ha utilizado con éxito para separar las células bacterianas de las matrices en las que están presentes (6) (nuestra aplicación de interés), la necesidad de un equipo especializado supone un impedimento para muchos laboratorios.

Aunque hay una serie de protocolos que se han descrito para aislar bacterias de varias matrices como alimentos (7-8), suelo (9) y tapetes microbianos (10) que hacen uso de centrífugas de mesa fácilmente disponibles para separar las células sobre la base de diferentes velocidades de sedimentación, los protocolos recomendados a menudo parecen ser ad hoc. Por ejemplo, Wang et al. (8) recomiendan la centrifugación a <1000×g durante un tiempo no especificado para eliminar los residuos cuando se aíslan las bacterias del queso blando, seguido de la centrifugación a 9000×g durante 3 minutos para recoger las bacterias. Del mismo modo, para aislar las bacterias de la carne homogeneizada, Neiderhauser et al. (7) recomendaron la centrifugación a 100×g (durante un tiempo no especificado) para eliminar las partículas de alimentos, seguida de la centrifugación a 3000×g (de nuevo, durante un tiempo no especificado) para recoger las bacterias. En otros casos, los protocolos recomendados implican múltiples rondas de centrifugación. Por ejemplo, para aislar bacterias de tapetes microbianos, Bey et al. (10) recomiendan no sólo centrifugar a 500×g durante 15 minutos, sino también resuspender el sedimento y repetir el procedimiento cuatro veces. De forma similar, para aislar bacterias del suelo, Bakken (9) recomienda la centrifugación repetida (durante un «número de veces») del homogeneizado de la muestra a 630-1060×g (durante un tiempo no especificado), seguida de resuspensión y rehomogeneización. También se han propuesto enfoques similares para aislar bacterias del caldo de cultivo de sangre «positivo». Para obtener aislamientos puros de bacterias antes de determinar su identidad mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, Stevenson et al. (11) utilizaron un procedimiento de centrifugación de varios pasos que incluía pasos de centrifugación secuenciales durante «1-2 minutos» cada uno a 8500, 1000 y 13.000 RPM (valor en g no especificado) con resuspensión del pellet en diferentes tampones en cada paso.

Estos protocolos citados no son en absoluto los únicos ejemplos de protocolos de centrifugación ad hoc caracterizados por la elección aparentemente arbitraria de las velocidades y/o tiempos de centrifugación. Una consecuencia importante de estos protocolos ad hoc es que no proporcionan ninguna base racional con la que otros puedan idear protocolos para aislar diferentes células objetivo de otras matrices/mezclas de células. Por ejemplo, es intuitivamente obvio que una centrifugación prolongada provocará la sedimentación de todas las partículas, mientras que una centrifugación de corta duración sólo sedimentará las partículas más rápidas, dejando la mayoría de las partículas más lentas en la suspensión. Sin embargo, determinar la velocidad/duración óptima de la centrifugación para aislar la partícula objetivo mientras se eliminan otras, sigue siendo un arte. En otras palabras, los protocolos actualmente comunicados no proporcionan una base racional para la modificación (determinación de las velocidades/tiempos de centrifugación óptimos) para otros objetivos de separación/aislamiento relacionados.

Materiales y métodos

Teoría

Nuestro método propuesto para separar dos tipos de partículas que tienen densidades similares, pero diferentes velocidades de sedimentación debido a las diferencias de tamaño, se ilustra en la Figura 1. Al principio del proceso (Figura 1(1)), la suspensión (caldo de cultivo de sangre, en nuestro caso) que contiene los separandos (glóbulos blancos o WBCs, glóbulos rojos o RBCs, plaquetas y bacterias) se carga como una capa separada sobre un tampón denso y claro (Histopaque 1083, en nuestro caso). La densidad del tampón es mayor que la de los glóbulos blancos (ρ = 1,06 – 1,08 g/mL (12)) y las plaquetas (ρ = 1,05 – 1,07 g/mL (13)), pero menor que la de los glóbulos rojos (ρ = 1,1 g/mL (14)) y las bacterias (ρ = 1,105 g/mL para Escherichia coli (15)). A medida que avanza la centrifugación, todas las partículas son impulsadas hacia abajo, primero a través de la capa superior (medio de cultivo de sangre) y luego hacia el tampón denso (el histopaco). Mientras que las partículas con densidades superiores a la del tampón (glóbulos rojos y bacterias) sedimentan tanto a través del caldo de cultivo de sangre como del tampón denso, los separandos menos densos (glóbulos blancos y plaquetas) son excluidos de este último. Este proceso es similar al protocolo recomendado para separar los glóbulos blancos y las plaquetas de la sangre total (16). Sin embargo, para nuestro propósito, este proceso por sí solo es insuficiente porque mientras algunas partículas no deseadas (glóbulos blancos y plaquetas) se separan de las partículas objetivo (bacterias) sobre la base de las diferencias de densidad, otras partículas que tienen densidades similares (glóbulos rojos) permanecen. Para lograr nuestro objetivo de recoger todas las células objetivo (bacterias) al tiempo que se eliminan todas las partículas no deseadas restantes (glóbulos rojos), proponemos llevar el sistema al estado representado en la figura 1(4), y detener el proceso de centrifugación allí. En este estado, todos los glóbulos rojos, que por su mayor tamaño tienen una mayor velocidad de sedimentación, se depositan en el fondo del tubo como un pellet, mientras que todas las células bacterianas se dispersan en el tampón denso.

Sin embargo, para llegar a este estado deseado hay que cumplir una serie de restricciones. En primer lugar, para garantizar que todas las bacterias se recojan en el tampón, debemos dejar tiempo suficiente para que las bacterias que empezaron en la parte superior (Plano A) migren a través de la capa de caldo de cultivo de sangre (Medio 1) y hacia el Histopaque (Medio 2). Matemáticamente, esto significa que:

donde, t es el tiempo durante el cual se ejecuta el proceso de centrifugación, l1 es la longitud de la columna de caldo de cultivo de sangre cargada, y vb1 es la velocidad de sedimentación de las bacterias en esta capa. Este punto en el tiempo (cuando las bacterias que comienzan en el plano A acaban de cruzar el plano B y entran en el tampón) se representa en la figura 1(2).

Otra característica destacada de este estado es que las bacterias y los glóbulos rojos pueden no haber formado «bandas» distintas en el tampón en ese momento. Mientras que los glóbulos rojos que comienzan en cualquier plano horizontal migran más lejos que las bacterias situadas de forma similar, los glóbulos rojos que comenzaron en el plano A pueden no haber superado a las bacterias que comenzaron en el plano B (interfaz entre los dos líquidos). Para que esto ocurra y para que los glóbulos rojos y las bacterias formen bandas distintas en el tampón, la columna de tampón debe ser lo suficientemente larga. No será posible que se formen bandas distintas si, por ejemplo, la columna de tampón se extiende sólo hasta el nivel mostrado por la línea discontinua en la figura 1(2). Matemáticamente, la condición de que los glóbulos rojos (partículas de asentamiento más rápido) que comienzan en el plano A superen a las bacterias (partículas de asentamiento más lento) que comienzan en el plano B puede expresarse como

donde l1 y l2 son las longitudes de las columnas de caldo de hemocultivo (Medio 1) y de tampón (Medio 2), respectivamente; vR1 y vR2 son la velocidad de sedimentación de los GR en el caldo y en el tampón, respectivamente; y vb2 es la velocidad de sedimentación de las bacterias en el tampón. La ecuación anterior puede reordenarse para obtener:

Además, sería deseable que todas las bacterias presentes originalmente en el Medio 1 se recogieran en el Medio 2. Esto significa que en el momento en que las bacterias que empiezan en la parte superior (Plano A) cruzan la interfaz entre las dos fases (Plano B), las que empiezan en el Plano B no deben haber llegado al fondo. Matemáticamente, esta condición se expresa como:

donde, vb1 es la velocidad de sedimentación de las bacterias en el Medio 1. Si se cumplen las ecuaciones (3) y (5), el sistema alcanzará el estado representado en la figura 1(4), en el que todos los glóbulos rojos han llegado al fondo del tubo y forman una capa separada, pero ninguna de las bacterias lo ha hecho. (Todas están en el medio 2). Este estado se produce por primera vez cuando todos los glóbulos rojos (incluso los que empiezan en el plano A) han llegado al fondo del tubo. Matemáticamente, ese instante de tiempo (t1) puede representarse como:

El estado deja de existir cuando las bacterias (las inicialmente presentes en la interfase, es decir, en el Plano B) empiezan a llegar al fondo del tubo. El tiempo en que esto ocurre (t2) viene dado por:

Así pues, para obtener la mejor separación posible, hay que (i) asegurarse de que las longitudes de las columnas de los dos medios satisfacen las ecuaciones (3) y (5); y (ii) que la duración durante la cual se ejecuta el proceso de sedimentación (tcentrifugación) viene dada por:

Continuar la centrifugación más tiempo que t2 dará lugar a la situación representada por la Figura 1(5), en la que algunas, o todas, las bacterias también sedimentan en el fondo. Para obtener aislados puros de las especies deseadas, el proceso de centrifugación debe detenerse en la etapa correspondiente a la figura 1(4), descartar la capa superior y extraer el tampón denso sin perturbar el sedimento del fondo. Si se desea, las partículas objetivo pueden centrifugarse y resuspenderse en otros medios.

Esta «ventana operativa» entre t1 y t2 se representa esquemáticamente en la Figura 2. Aquí, la abscisa muestra el tiempo de centrifugación, mientras que la ordenada muestra la fracción de partículas de glóbulos rojos y bacterias que están presentes en el tampón denso (Medio 2). Para ambos, la fracción aumenta inicialmente a medida que migran desde la capa superior, se mantiene constante durante un tiempo a medida que migran como una banda a través del tampón denso, y finalmente disminuye a medida que se depositan en el fondo. Los glóbulos rojos que se mueven más rápido tienen una pendiente de subida/bajada más pronunciada, así como un periodo más corto cuando todos ellos están presentes en el tampón denso. Durante la «ventana operativa» (caja nublada), prácticamente todas las bacterias (∼100%) están presentes en el tampón, pero prácticamente no hay glóbulos rojos (∼ 0%).

Las velocidades de sedimentación de los glóbulos rojos y de las bacterias (que determinan los valores numéricos de las restricciones dadas por las ecuaciones 3,5 y 8) pueden predecirse basándose en sus respectivas formas, tamaños y densidades. La velocidad de sedimentación de viene dada (17) por la ecuación:

donde, ρ y ρl son las densidades de la partícula y del líquido, respectivamente, µ es la viscosidad del líquido, R es el radio efectivo de la partícula, y g es la aceleración por gravedad/centrifugación. Las E. coli son bacterias con forma de bastón, de 2 micras de longitud y 0,5 micras de diámetro (18). Por lo tanto, podemos modelarlas como esferoides prolados, cuyo radio de sedimentación efectivo (R) viene dado (19) por:

donde a, y b son las semilongitudes de los ejes mayor y menor. Así, para E. coli, a = 1 micra, y b = 0,25 micras. Basándonos en estos valores, esperamos que E. coli tenga una velocidad de sedimentación de 26,7 micras/segundo a través del líquido superior, y una velocidad de 6,56 micras/segundo a través del Histopaque 1083.

Por otro lado, los glóbulos rojos humanos son discos bicóncavos, de 7-8 micras de diámetro y 2 micras de espesor (20). Por lo tanto, pueden modelarse como esferoides oblatos cuyo radio de sedimentación efectivo viene dado (19) por:

donde, a y b son la mitad de las longitudes de los ejes mayor y menor respectivamente. Con valores de 4 micras para a, y 1 micra para b, predecimos que cuando se somete a centrifugación utilizando nuestro instrumento, un Eppendorf-5804, a una fuerza centrífuga relativa de 400×g, los glóbulos rojos sedimentarán con una velocidad de 500 micras/segundo a través de la capa superior de densidad ∼102 g/mL (según nuestras mediciones), y de 101 micras/segundo a través de la Histopaque (densidad = 1,083 g/mL).

La velocidad de sedimentación de las partículas puede predecirse con mayor precisión si se tienen en cuenta las interacciones partícula-partícula. Estas interacciones partícula-partícula surgen cuando el líquido desplazado hacia arriba por una partícula en sedimentación impacta con otras partículas inmediatamente detrás o al lado de la primera, sometiendo a estas últimas a un mayor arrastre de fluido y reduciendo así la velocidad de sedimentación efectiva (media) de las partículas como grupo. Este fenómeno se denomina «sedimentación obstaculizada» y debe tenerse en cuenta cuando la fracción de volumen de las partículas no es despreciable. Existen varias expresiones semi-analíticas o empíricas para calcular las velocidades efectivas de sedimentación en sistemas con sedimentación obstaculizada (21). Uno de estos enfoques es la Correlación Richardson-Zaki, donde la velocidad efectiva de sedimentación (v′) viene dada por:

donde v es la velocidad de sedimentación de la partícula en el caso no obstaculizado, y φ es la fracción de volumen de las partículas. La sangre suele diluirse en el caldo de hemocultivo a una dilución de 1:4 (22). Dado que el hematocrito (fracción de volumen de los glóbulos rojos en la sangre) suele ser de entre 0,4 y 0,45 (23), la fracción de volumen resultante de los glóbulos rojos en nuestra muestra es de aproximadamente 0,1. Si se tiene en cuenta esto mediante la ecuación 12, las velocidades de sedimentación previstas para los glóbulos rojos en los medios 1 y 2 son de 307 micras/segundo y 62 micras/segundo, respectivamente. Además, en el momento en que los hemocultivos dan positivo, contienen ∼108 UFC (unidades formadoras de colonias) (células) de bacterias por mL de suspensión (24). Sin embargo, debido a su pequeño tamaño (radio ∼1 micra), su fracción de volumen sigue siendo inferior a 0,001, y puede despreciarse el efecto de «sedimentación obstaculizada».

Dado un volumen de muestra del que se desea aislar el(los) tipo(s) de célula(s) de interés, el diagrama de flujo proporcionado en los materiales suplementarios (Figura Suplementaria 1) puede utilizarse para guiar la elección del tampón de sedimentación, predecir las velocidades de sedimentación de las células de interés en dicho tampón, determinar el volumen apropiado (longitud de la columna en el tubo de centrifugación disponible) que debe utilizarse y, finalmente, calcular la duración óptima de la centrifugación (ventana de funcionamiento) utilizando la(s) centrífuga(s) disponible(s). Para nuestro sistema (5 ml de caldo de hemocultivo «positivo» cargado en tubos de centrífuga de 15 ml), el proceso se resume en la Tabla 1.

Tabla 1. Predicciones teóricas de las longitudes mínimas de las columnas y los tiempos mínimos/máximos de funcionamiento.

Validación experimental

Primero preparamos un «caldo de cultivo de sangre positivo» sintético dispersando en 8ml de medio BACTEC Ped-Plus (Becton Dickinson, Sparks, MD), 2ml de sangre fresca (extraída de un voluntario) y 0.1ml de una suspensión que contenía ∼104 UFC (células) por mL de E. coli K-12 e incubando la mezcla en un mezclador de nuez a 37°C durante toda la noche (12-14 h) para obtener una suspensión que contenía ∼109 glóbulos rojos/mL y 108 UFC/mL de bacterias. Se tomaron 1,5 mL del caldo en un tubo de microcentrífuga (Eppendorf, Nueva York, EE.UU.) y se «pelletearon» las células por centrifugación. Se retiró el sobrenadante y se midió la masa de 1 ml utilizando una balanza (OHaus® GA-110) para estimar la densidad del líquido en el caldo.

Además, se cargaron 5 mL del caldo de hemocultivo positivo sobre 5 mL de Histopaque-1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA). Se cargaron múltiples tubos de este tipo en una centrífuga de sobremesa Eppendorf-5804 y se centrifugaron durante periodos de tiempo variables (1 min, 3 min, 6 min, 10 min, 15 min, 30 min, 50 min, 70 min y 90 min). Al final del proceso de centrifugación, se retiró suavemente el tubo, se desechó la capa superior (caldo de hemocultivo) y se recogió la capa histopática sin perturbar el sedimento del fondo (si estaba presente). La concentración de bacterias en el líquido recogido se analizó mediante métodos estándar que incluían la dilución en serie, la siembra en Agar de Soja Tríptico, la incubación y el recuento de colonias (25). Las concentraciones de glóbulos rojos se obtuvieron examinando una alícuota de la muestra en un hemocitómetro bajo el microscopio (26).

Resultados y discusión

Los resultados se resumen en la figura 3. Las líneas representan el número teórico de células sanguíneas o bacterias que se espera que estén presentes en la capa Histopaque (menos el sedimento en la parte inferior) en base a nuestras predicciones teóricas. Los símbolos sólidos representan la media de al menos tres lecturas del número observado de glóbulos rojos (cuadrados) y de E. coli (diamantes). Las barras de error son la desviación estándar.

Como se ve en la Figura 3, el comportamiento observado coincide cualitativamente con nuestras predicciones; para ambas partículas densas (glóbulos rojos y bacterias), las concentraciones en el Histopaque aumentan inicialmente con el tiempo, luego se mantienen constantes durante cierta duración y finalmente disminuyen. Sin embargo, se encontró que para los glóbulos rojos, todo el proceso (aumento, estado estable y caída) ocurre ligeramente más lento de lo predicho. El efecto de esta velocidad de sedimentación ligeramente inferior, afortunadamente, no afecta a nuestra ventana operativa, ya que el inicio de la ventana se rige por el tiempo necesario para que todas las bacterias entren en el tampón denso. Para cuando esto ocurre, la concentración de glóbulos rojos en el tampón denso es insignificante. En otras palabras, se observa que la ventana operativa predicha por nuestros modelos (∼20 min a ∼75 min) se mantiene.

La mayoría de las bacterias que aparecen comúnmente son también bastante pequeñas (∼1 micra de longitud característica) y sus densidades son similares. (por ejemplo, 1,1 g/mL para Pseudomonas (27); 1,13 g/mL para Streptococcus (28), y 1,135 g/mL para Bacillus (29)). Por lo tanto, es probable que tengan velocidades de sedimentación comparables a las de E. coli tanto en el caldo de hemocultivo como en el Histopaque-1083 y, en consecuencia, la ventana operativa también debería ser similar. Aunque nuestra ventana operativa (∼20 min a ∼75 min) es aplicable solo para nuestro hardware y parámetros experimentales, nuestro análisis teórico proporciona una base para predecir otras ventanas operativas, no solo con el fin de aislar bacterias de caldos de hemocultivo positivos utilizando diferentes hardware, sino también para aislar otras células objetivo de diferentes matrices utilizando tampones densos. Este método también puede utilizarse de forma secuencial para aislar un objetivo de una mezcla que contenga especies de sedimentación más rápida y más lenta. En tales casos, uno utilizaría nuestro método para eliminar primero todas las especies de movimiento más rápido y, posteriormente, utilizarlo para recoger el objetivo de especies de asentamiento más rápido en la mezcla restante.