Efecto del extracto acuoso de Atractylodes macrocephala Koidz administrado por vía oral sobre la respuesta inflamatoria de macrófagos y células T en ratones

Abstract

El rizoma de Atractylodes macrocephala Koidz (AM) es un componente de varias recetas de compuestos potenciadores del Qi. Se evaluaron las respuestas inflamatorias en macrófagos y células T aisladas de ratones tras la administración oral de extracto acuoso de AM (AME). Se aislaron células de exudado peritoneal de ratones inyectados con tioglicolato y se examinaron las alteraciones de los receptores scavenger. Se estimularon los macrófagos peritoneales con lipopolisacárido (LPS). También se evaluaron las respuestas de las citoquinas séricas a la inyección intraperitoneal de LPS. Se aislaron los esplenocitos y se midió su composición y sus respuestas funcionales. El contenido de atractylenolide I y atractylenolide III, conocidos ingredientes antiinflamatorios, en la AME fue de 0,0338 mg/g de extracto y 0,565 mg/g de extracto, respectivamente. El AME aumentó el número de células SRA(+)CD11b(+) en respuesta al tioglicolato. Los macrófagos peritoneales aislados del grupo AME no mostraron cambios en los marcadores inflamatorios como el factor de necrosis tumoral (TNF-) α, la interleucina (IL-) 6, la óxido nítrico sintasa inducible y la ciclooxigenasa-2, pero mostraron una disminución de la expresión de CD86. Curiosamente, la AME redujo los niveles séricos de TNF-α e IL-6 tras la inyección intraperitoneal de LPS. En cuanto al sistema inmunitario adaptativo, la AME aumentó la población de células T CD4(+) y la expresión de la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II en el bazo, y los esplenocitos cultivados del grupo AME mostraron una mayor producción de IL-4 junto con una menor producción de interferón-γ durante la activación de las células T. La AME promovió la reposición de macrófagos peritoneales durante la respuesta inflamatoria, pero su actividad antiinflamatoria no pareció estar mediada por la modulación de la actividad de los macrófagos. La AME también alteró el estado inmunitario de las células T CD4, promoviendo la respuesta Th2.

1. Introducción

La inflamación es una respuesta protectora para eliminar los estímulos perjudiciales, y las células inmunitarias son las principales participantes en este proceso. Según la modalidad de reconocimiento del antígeno y la capacidad de generar una respuesta de memoria, las células inmunitarias se dividen en sistema inmunitario innato y sistema inmunitario adaptativo . Las células inmunitarias innatas, como los macrófagos y las células dendríticas, reaccionan instantáneamente al antígeno con una especificidad de receptor limitada . Las células inmunitarias adaptativas, formadas por las células T y las células B, son específicas del antígeno, inician una respuesta al antígeno que ha entrado en el tejido linfoide periférico y generan una respuesta de memoria. Las células inmunitarias innatas son las principales protagonistas en las primeras fases de la inflamación, pero con el tiempo, las células inmunitarias adaptativas toman el relevo.

Los macrófagos residentes en los tejidos desempeñan un papel clave en la inmunidad y la integridad de los tejidos . La mayoría de los macrófagos tisulares derivan de precursores embrionarios . En condiciones estables, sus poblaciones se mantienen gracias a su longevidad y a la proliferación local, y algunos macrófagos se reponen con células derivadas de monocitos sanguíneos. Durante la inflamación, los monocitos derivados de la médula ósea son reclutados en el lugar y se diferencian en macrófagos. Los macrófagos eliminan los patógenos y los antígenos mediante la fagocitosis e inducen respuestas inflamatorias mediante la producción de citoquinas y enzimas como el factor de necrosis tumoral (TNF-) α, la interleucina (IL-) 6, la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la ciclooxigenasa (COX-) 2. Además, los macrófagos son un tipo de células presentadoras de antígenos (APC) profesionales que presentan antígenos a las células T.

Las células T, que consisten principalmente en células T CD4 y células T CD8, se activan cuando los receptores de células T (TCR) entran en contacto con péptidos antigénicos unidos por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las APC. Los linfocitos T CD4, que representan más de dos tercios de los linfocitos T, pueden diferenciarse en varios linfocitos T auxiliares efectores (Th), como Th1, Th2, Th17, T auxiliares foliculares y T reguladores. Entre estos subconjuntos, las células Th1 y Th2 fueron los primeros tipos en ser definidos. Las células Th1 secretan altos niveles de interferón (IFN-) γ y son eficaces en la defensa contra los patógenos intracelulares mediante la activación de los macrófagos, mientras que las células Th2 secretan interleucina (IL-) 4, IL-5 e IL-13 y protegen al huésped de las infecciones por helmintos mediante el reclutamiento de eosinófilos y mastocitos . Aunque estas células T helper son importantes para la defensa del huésped, la activación crónica de cualquier tipo de célula Th puede causar trastornos inmunológicos. Las células Th1 desempeñan un papel fundamental en la autoinmunidad específica de los órganos y en los trastornos inflamatorios crónicos, y las células Th2 son responsables de la inflamación alérgica.

El rizoma de Atractylodes macrocephala Koidz (AM), perteneciente a las Compositae, se ha utilizado para el tratamiento de los defectos funcionales del sistema digestivo, como la pérdida de apetito, la distensión abdominal y la diarrea. Según la medicina tradicional china, la AM vigoriza el Qi resolviendo la retención anormal de líquidos en el tracto gastrointestinal. El AM es un componente de varias recetas de compuestos potenciadores del Qi. En la medicina tradicional china, una de las funciones esenciales del Qi es la defensa. Por esta razón, se cree que las hierbas potenciadoras del Qi mejoran el sistema inmunitario. Dado que las hierbas potenciadoras del Qi se toman de forma preventiva para mejorar el estado inmunitario de los individuos sin defectos manifiestos, es necesario evaluar cómo puede alterarse el sistema inmunitario en individuos normales tras la administración de AM. A pesar de su uso frecuente, se han realizado pocos estudios para explorar los efectos de la AM en el sistema inmunitario.

La AM contiene varios sesquiterpenoides bioactivos como el atractylenolide I, el atractylenolide II y el atractylenolide III y los poliacetilenos . El tratamiento in vitro de los macrófagos con atractylenolide I, atractylenolide III y algunos compuestos poliacetilénicos inhibió la expresión de TNF-α e iNOS inducida por el lipopolisacárido (LPS). La administración oral de estos componentes liposolubles mostró actividad antiinflamatoria en ratones . Sin embargo, la mayoría de los preparados herbales tradicionales son decocciones a base de agua, lo que da lugar a un bajo rendimiento de los componentes liposolubles farmacológicamente activos. Además, los poliacetilenos pueden destruirse fácilmente en el agua hirviendo. Por lo tanto, quisimos comprobar si se producen respuestas antiinflamatorias en macrófagos aislados de ratones a los que se les administró AM extraído en agua hirviendo (AME). También examinamos el efecto de la AME en la respuesta inflamatoria sérica. Por último, examinamos la composición y la respuesta funcional de los esplenocitos para detectar cualquier alteración en el sistema inmunitario adaptativo tras la suplementación con AME.

2. Materiales y métodos

2.1. Preparación de la muestra

La AME originaria de Eusung (Corea del Sur) se adquirió de E-Pulip Co. (Lote. EPL1356-4) (Seúl, Corea del Sur). Se depositó un espécimen de muestra (# 2013-AM) en el Laboratorio de Inmunología Herbal de la Universidad Kyung Hee. Brevemente, se molieron 100 g de muestra, se extrajeron con 1 L de agua desionizada (DW) en un aparato de reflujo y manto térmico durante 2 h a 95°C, y se filtraron con papel de filtro Whatman número 2 (Whatman International, Kent, Inglaterra). El extracto se concentró utilizando un evaporador rotatorio y se liofilizó al vacío. El rendimiento de AME fue del 37,7%. Para el análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), se disolvieron 0,4 g de AME en 10 ml de DW y se sonicaron durante 5 minutos a 25°C. El extracto se añadió al acetato de etilo, se agitó para mezclarlo y se dejó reposar durante 1 minuto. Se transfirió la capa superior de acetato de etilo y se repitió este procedimiento tres veces. La capa final de acetato de etilo se concentró y se liofilizó.

2.2. HPLC

Las muestras se analizaron mediante un sistema HPLC de fase inversa (Shimadzu 20A, Kioto, Japón) que constaba de un automuestreador (SIL-20A), una bomba binaria (LC-20AD) y un detector de matriz de fotodiodos (SPD-20A) y estaba equipado con una columna YMC-Triart C18 (5 μm × 4,6 mm × 250 mm) (YMC, Kioto, Japón). Los flujos de gradiente para el sistema de dos disolventes (disolvente A, ácido fosfórico al 0,05% en agua; disolvente B, acetonitrilo) fueron los siguientes 85% A/15% B a los 0 min, 85% A/15% B a los 5 min, 50% A/50% B a los 15 min, 50% A/50% B a los 20 min, 40% A/60% B a los 25 min, 40% A/60% B a los 30 min, 15% A/85% a los 35 min, 15% A/85% a los 40 min, 85% A/15% a los 42 min y 85% A/15% a los 45 min. El caudal de la fase móvil fue de 1,0 ml/min con un volumen de inyección de 10 μl. La detección se realizó a 220 nm para el atractylenolide III (Sigma, St. Louis, MO, USA) o a 280 nm para el atractylenolide I (Sigma).

2.3. Animales

Los ratones Balb/c de siete semanas de edad se obtuvieron de SamTaco (Osan, Corea del Sur) y se alojaron en una instalación de animales libre de patógenos con temperatura y humedad controladas y un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Todos los animales fueron sometidos a una semana de adaptación antes de los experimentos. Las dosis se determinaron mediante un cálculo extrapolado a partir de la diferencia de superficie corporal entre un ratón y un ser humano. La dosis recomendada de AM para un humano adulto de 60 kg es de 8 a 24 g de planta cruda por día o de 3 a 9 g de extracto por día (basado en el rendimiento de la extracción en este estudio). La dosis para el ratón puede determinarse de la siguiente manera: una dosis humana equivalente de 50-150 mg/kg × 12,3 (el coeficiente de conversión) = una dosis para el ratón de 615-1.845 mg/kg. Basándonos en este rango de dosis, elegimos dosis de 500 mg/kg y 2.500 mg/kg para este estudio. Los animales fueron asignados aleatoriamente a los grupos experimentales. La AME se administró por vía oral una vez al día durante 10 días. No hubo diferencias en el peso corporal entre los grupos durante el período experimental. El protocolo de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kyung Hee (KHUASP(SE)-15-012), y los ratones se cuidaron de acuerdo con las especificaciones del Consejo Nacional de Investigación de EE.UU. para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (1996).

2.4. Preparación de macrófagos

Para el aislamiento de macrófagos, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con 2 ml de tioglicolato estéril al 3,5% (BD, Sparks, MD, USA) 4 días antes del sacrificio. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y las células del exudado peritoneal se aislaron asépticamente mediante un lavado peritoneal con DMEM frío (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.) que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS; Hyclone) y un 1% de penicilina-estreptomicina. Tras la centrifugación, las células se resuspendieron y se contaron utilizando un contador celular TC20 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).

2.5. Preparación de los esplenocitos

Para el aislamiento de los esplenocitos, los bazos se obtuvieron asépticamente al final del experimento. Tras disgregar el bazo entre portaobjetos de vidrio en RPMI 1640 (Hyclone) con 1% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina, las células se filtraron a través de un colador celular de 70-μm. Tras la centrifugación, los glóbulos rojos se lisaron con el tampón de lisado BD PharmLyse (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Las células se resuspendieron en RPMI 1640 con un 10% de FBS y un 1% de penicilina-estreptomicina y se contaron utilizando un contador celular T20.

2.6. Inyección intraperitoneal de LPS

Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 1,3 mg/kg de LPS (serotipo 055:B5, Sigma) al final del experimento. Después de 1 h, se anestesió a los ratones con éter y se recogió sangre por punción cardíaca. Se obtuvo suero y se almacenó a -20°C hasta su análisis.

2.7. Cultivo celular

Las células del exudado peritoneal se colocaron en placas de 6 pocillos o en placas de 60 mm y se incubaron durante la noche a 37°C. Después de eliminar las células no adherentes, se estimularon las células adheridas con 100 ng/ml de LPS durante 24 h. Se recogió el sobrenadante y las células para los ensayos posteriores. Los esplenocitos se colocaron en placas de 24 pocillos y se estimularon con 2 μg/ml de anticuerpos anti-CD3 (BD Biosciences) durante 48 h. Se recogió el sobrenadante para el análisis de las citoquinas.

2.8. Citometría de flujo

Las células se lavaron dos veces en tampón fosfato salino (PBS) y se resuspendieron a 1 × 106 células/ml en tampón FACS (PBS/0,1% NaN3/1% FBS). Las células se bloquearon con un anticuerpo CD16/CD32 de rata (BD Biosciences) a 4 °C durante 5 minutos y, a continuación, se tiñeron con un anticuerpo SR-AI de ratón conjugado con fluoresceína, un anticuerpo LOX1 de ratón conjugado con PE (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), un anticuerpo CD36 de ratón conjugado con PE, CD11b conjugado con FITC, anti-CD11b conjugado con PE, anti-CD86 de ratón conjugado con PE, anti-CD4 de ratón conjugado con FITC, anti-CD8a de ratón conjugado con PE, anti-CD19 de ratón conjugado con FITC y anti IA/IE de ratón conjugado con FITC (BD Biosciences) (todos los anticuerpos se diluyeron al 1100) durante 30 minutos en hielo y en la oscuridad. Se utilizaron anticuerpos de isotipo coincidente para mostrar la unión no específica. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS. Se adquirieron un total de 10.000 eventos en un citómetro de flujo Navios (Beckman Coulter, La Brea, CA, EE.UU.), y los datos se procesaron utilizando el software Kaluza (Beckman Coulter).

2.9. Análisis de citoquinas

Los niveles de TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-4 en sobrenadantes y sueros se determinaron utilizando los juegos de ELISA para ratones BD OptEIA (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2.10. Ensayo de proliferación

Los esplenocitos (4 × 105) en placas de 96 pocillos se estimularon con mAb soluble anti-CD3 (2 μg/ml) durante 48 h. La proliferación celular se determinó utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CellTiter96 One Solution (Promega, Madison, WI, USA).

2.11. El ARN total se aisló utilizando un kit de purificación de ARN total FavorPrep (Favorgen Biotech, Pingtung, Taiwán), y el ADNc se transcribió de forma inversa utilizando un kit de conversión de ARN en ADN de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El ADNc diluido se mezcló con la mezcla maestra de PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems) y con 2 pmol de cebadores específicos para iNOS, COX2 o GAPDH. La amplificación del ADNc se realizó con un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems). Tras una desnaturalización térmica inicial a 95°C durante 10 minutos, las condiciones de la PCR se fijaron en 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto para 40 ciclos. Para cada PCR, se incluyó una muestra de ARNm correspondiente sin transcripción inversa como control negativo. La cuantificación del número de copias de ADNc se realizó mediante una curva estándar.

2.12. Análisis estadístico

Los datos se presentaron como media del error estándar de la media (SEM). Se aplicó la prueba t de Student de dos caras o el análisis de varianza de dos vías para comparar las diferencias entre los grupos. Si el análisis estadístico mostraba que las diferencias entre varios grupos eran significativas, se utilizó la prueba post hoc de Tukey para realizar nuevas comparaciones. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software IBM SPSS 22.0 (IBM, Chicago, IL, EE.UU.). Los valores P inferiores a 0,05 se consideraron significativos.

3. Resultados

3.1. Contenido de Atractylenolide I y Atractylenolide III en AME

Entre los marcadores de control de calidad conocidos, atractylenolide I y atractylenolide III son compuestos antiinflamatorios verificados in vitro . La fracción de acetato de etilo de AME se identificó tentativamente utilizando una entrada de estándares auténticos con la comparación de los tiempos de retención y los patrones espectrales UV-visibles. Los cromatogramas de HPLC se muestran en la Figura 1. El contenido de atractylenolide I y atractylenolide III en AME fue de 0,0338 mg/g de extracto y 0,565 mg/g de extracto, respectivamente.

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Efecto de la administración oral de AME sobre la expresión de receptores Scavenger en células de exudado peritoneal de ratón

La inyección intraperitoneal de tioglicolato se utiliza habitualmente para inducir peritonitis estéril y enriquecer los macrófagos peritoneales de los ratones en los laboratorios . La mayoría de los macrófagos peritoneales se derivan de los monocitos sanguíneos. Con este método recogimos células del exudado peritoneal de ratones tratados con AME. Se utilizó CD11b como marcador de macrófagos. Los receptores scavenger, como SRA, CD36 y LOX-1, se regulan durante la diferenciación de monocitos a macrófagos, por lo que examinamos la expresión de estas proteínas. SRA, CD36 y LOX-1 se expresaron casi exclusivamente en las células CD11b(+) (Figuras 2(a)-2(c)). El porcentaje de células SRA(+)CD11b(+) en el grupo de control era del 66%, y el tratamiento con 500 mg/kg y 2.500 mg/kg de AME aumentó significativamente esta población hasta el 69% y el 76%, respectivamente. Las frecuencias de las poblaciones de células CD36(+)CD11b(+) y LOX-1(+)CD11b(+) en el grupo de control fueron del 95% y el 14%, respectivamente, y la AME no indujo cambios significativos en ambas poblaciones. El aumento de la población celular SRA(+)CD11b(+) indica que la AME puede estimular la diferenciación de los monocitos sanguíneos en macrófagos en respuesta al tioglicolato.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.3. Efecto de la administración oral de AME sobre la expresión superficial de CD86 en macrófagos estimulados por LPS

Las moléculas coestimuladoras como CD86 en macrófagos son necesarias para reforzar la diafonía entre macrófagos y células Th . Los macrófagos peritoneales aislados de ratones tratados con AME fueron estimulados con LPS durante 24 h y se midió la expresión de CD86 en la membrana mediante citometría de flujo. La estimulación con LPS aumentó la intensidad media de fluorescencia de CD86 de 5,24 a 11,24 (Figura 3). La intensidad media de fluorescencia de CD86 en los grupos de 500 y 2.500 mg/kg disminuyó significativamente a 10,14 y 10,59, respectivamente. Estos resultados indican que la AME puede afectar a la interacción entre los macrófagos y las células Th.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.4. Efectos de la administración oral de AME sobre la respuesta de citoquinas inflamatorias en macrófagos y suero

En primer lugar, examinamos si la administración oral de AME afecta a la respuesta inflamatoria de los macrófagos. Los macrófagos peritoneales del grupo de control o de dosis altas de AME fueron estimulados con LPS durante 24 h y se midió la producción de TNF-α e IL-6 en el sobrenadante. No hubo diferencias en el nivel de secreción de TNF-α entre los grupos de control y de AME, pero el nivel de IL-6 aumentó en el grupo de AME (Figura 4(a)). También comprobamos que la AME no indujo ninguna alteración en la expresión de los genes iNOS y COX-2 en las células estimuladas con LPS (Figura 4(b)). A continuación, examinamos la respuesta sistémica de los ratones tratados con AME a la estimulación intraperitoneal con LPS. La AME redujo los niveles séricos de TNF-α e IL-6 en un 20% y un 47%, respectivamente (Figura 5). Estos resultados indican que la actividad antiinflamatoria de la AME puede producirse independientemente de la modulación de los macrófagos.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

Efectos de la administración oral de AME en las respuestas inflamatorias séricas tras la inyección intraperitoneal de LPS. Se administró AME (2500 mg/kg) por vía oral a ratones durante 10 días. Se obtuvo suero 1 h después de la inyección intraperitoneal de LPS (1,3 mg/kg) y se determinaron los niveles séricos de TNF-α e IL-6 mediante ELISA. Los datos representan la media ± SEM (n=10). (-): sin LPS, (+): Tratamiento con LPS. # P<0,001 frente al control (-), P <0,05, P <0,001 frente al control (+).

3.5. Efectos de la administración oral de AME en las poblaciones de células T y B esplénicas y en la expresión del MHC II

Para determinar si la administración oral de AME altera las células inmunitarias adaptativas, se analizaron los porcentajes de células T CD4 y CD8 esplénicas y de células B en los grupos de control y de AME. La población de células T CD4(+) aumentó significativamente del 23,4% al 27,2% y 26,9% en los grupos de 500 y 2.500 mg/kg, respectivamente (Figuras 6(a) y 6(d)). No se observaron diferencias en las poblaciones de células T CD8 y células B (Figuras 6(a), 6(b) y 6(d)). Las moléculas MHC de clase II son necesarias para la presentación de antígenos a las células T CD4. Analizamos la expresión esplénica de las moléculas MHC de clase II de ratón IA/IE y descubrimos que la intensidad media de fluorescencia de las moléculas MHC II aumentó significativamente de 65,3 a 68,9 en el grupo de 2.500 mg/kg de AME (Figuras 6(c) y 6(e)). Estos resultados sugieren que la AME induce alteraciones en el sistema inmunitario adaptativo.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

3.6. Efectos de la administración oral de AME sobre la proliferación de células T y la respuesta de citoquinas Th1/Th2 en los esplenocitos

Investigamos la función de las células T esplénicas tras el tratamiento con AME. Se estimularon esplenocitos aislados de grupos de control o de AME con anticuerpo anti-CD3, un mitógeno que activa toda la población de células T independientemente de la especificidad del receptor del antígeno. El tratamiento con el anticuerpo anti-CD3 durante 48 horas aumentó la densidad óptica 2,6 veces, medida por el ensayo MTS. No hubo diferencias en la proliferación inducida por el anticuerpo anti-CD3 entre los grupos de control y AME (Figura 7(a)). El IFN-γ y la IL-4 son citocinas representativas de las células Th1 y Th2, respectivamente. Se evaluó la secreción de IFN-γ e IL-4 en los esplenocitos estimulados con el anticuerpo anti-CD3. Se observó una reducción significativa de la secreción de IFN-γ en el grupo de 500 mg/kg de AME, mientras que la secreción de IL-4 aumentó significativamente en el grupo de 2.500 mg/kg (Figura 7(b)). Aunque no se observó un efecto dependiente de la dosis, la AME tendió a promover la respuesta Th2.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 7

Efectos de la AME en la proliferación y secreción de citoquinas de las células T esplénicas activadas. Se cultivaron esplenocitos aislados de los grupos de control y AME y se estimularon con anticuerpos anti-CD3 (2 μg/ml) durante 48 h. (a) La respuesta proliferativa de los esplenocitos se determinó mediante el ensayo MTS. (b) La secreción de citoquinas a las 48 h de estimulación se midió mediante ELISA. Las barras representan la media±SEM (n=6). (-): sin anticuerpos anti-CD3, (+): tratamiento con anticuerpos anti-CD3. # P <0,001 frente al control (-), P <0,05 frente al control (+).

4. Discusión

En la medicina tradicional china, se espera que las hierbas potenciadoras del Qi mejoren el sistema inmunitario. En este estudio, nos centramos específicamente en las respuestas inflamatorias de los macrófagos y las células T aisladas de ratones a los que se les administró AME por vía oral.

La peritonitis estéril inducida con tioglicolato fue introducida por primera vez en 1964 por Gallily et al. y desde entonces ha sido el método más utilizado para el aislamiento de macrófagos primarios . El día 4 después de la inyección intraperitoneal de tioglicolato, el número total de células del exudado peritoneal se multiplica aproximadamente por 5. Entre estas células, los macrófagos son el tipo celular predominante, seguido de los eosinófilos . El origen del aumento del número de macrófagos peritoneales en los ratones inyectados con tioglicolato son los monocitos sanguíneos derivados de la médula ósea. El aumento de los receptores scavenger se produce durante el proceso de diferenciación de monocitos a macrófagos. Los receptores scavenger, un tipo de receptores innatos de los macrófagos, son responsables de la fagocitosis y reconocen específicamente los ligandos polianiónicos. Utilizamos CD11b y varios marcadores de receptores scavenger para identificar macrófagos derivados de monocitos en las células del exudado peritoneal y descubrimos que la población de células CD11b(+)SRA(+) aumentó significativamente en el grupo de AME. Esto sugiere que la administración de AME promueve el reclutamiento y la diferenciación de monocitos sanguíneos a macrófagos en respuesta al tioglicolato.

El LPS es reconocido por el complejo de receptores tipo Toll (TLR)-4/MD-2. TLR4 induce respuestas inflamatorias a través de dos moléculas adaptadoras, MyD88 y TRIF . La vía de señalización dependiente de MyD88 activa el NF-κB y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) para inducir genes inflamatorios como el TNF-α y la IL-6 . La vía de señalización dependiente de TRIF activa el factor regulador del interferón 3 para producir IFN-β, que es necesario para la regulación de las moléculas coestimuladoras. La vía de señalización de TRIF también participa en la activación de NF-κB y MAPK, pero de forma retardada respecto a la vía dependiente de MyD88. La subida de las moléculas costimuladoras depende únicamente de TRIF, mientras que las respuestas inflamatorias son codependientes de MyD88 y TRIF. No hubo ningún efecto inhibidor sobre los marcadores inflamatorios probados en los macrófagos del grupo AME. En cambio, la expresión de CD86 disminuyó. La CD86 de los macrófagos se une a la CD28 de las células Th para reforzar la actividad de las células Th. Nuestros resultados indican que la administración oral de AME no afecta a las respuestas inflamatorias dependientes de NF-κB y MAPK en los macrófagos, sino que interfiere específicamente en la vía dependiente de TRIF que conduce únicamente a la expresión de CD86. Se necesitan más estudios para evaluar si AME causa alteraciones en una situación patológica en la que predominan los macrófagos y las células Th.

El sistema de macrófagos estimulados por LPS es un modelo in vitro muy común para evaluar la actividad antiinflamatoria de productos naturales o candidatos a fármacos. Utilizando este modelo, es fácil obtener el resultado deseado con componentes solubles en lípidos porque pueden penetrar fácilmente en la membrana celular. Nuestros datos mostraron que los macrófagos peritoneales aislados de ratones a los que se les administró AME por vía oral no mostraron efectos antiinflamatorios ex vivo, lo que contradice los resultados in vitro comunicados anteriormente. En cambio, se observó una actividad antiinflamatoria de la AME en la respuesta sérica del TNF-α y la IL-6 tras la inyección intraperitoneal de LPS. Es muy probable que esta actividad antiinflamatoria sistémica esté mediada por la modulación de los macrófagos. Una de las diferencias entre las condiciones in vivo e in vitro es que el LPS es transportado en la circulación por varias lipoproteínas y luego eliminado por los hepatocitos in vivo, mientras que este evento no puede ser imitado in vitro . La eliminación del LPS puede evitar la sobreestimulación de los macrófagos hepáticos. Queda por determinar si la actividad antiinflamatoria sistémica de la AME está relacionada con el aclaramiento del LPS en el hígado. Se obtuvo un resultado similar en macrófagos peritoneales aislados de ratones a los que se les administró extracto acuoso de Astragalus membranaceus por vía oral (datos no publicados). El Astragalus membranaceus y el AM pertenecen a la misma categoría de hierbas tonificantes del Qi. En este momento, no sabemos si la actividad antiinflamatoria in vivo que no implica la modulación de los macrófagos es exclusiva de estas plantas medicinales o una propiedad común inducible por las plantas medicinales tonificantes del Qi, y necesitamos acumular más datos para sacar cualquier conclusión. Además, Li et al. informaron que el atractylenolide I y el 14-acetoxy-12-senecioyloxytetradeca-2E,8E,10E-trien-4,6-diyn-1-ol, un tipo de compuesto poliacetilénico aislado de AM, tienen una estructura molecular que interactúa con el receptor de glucocorticoides unido a la membrana . Según su estudio, 300 mg/kg de atractylenolide I por vía oral y 30 mg/kg de poliacetileno por vía oral fueron las dosis mínimas necesarias para mostrar efectos antiinflamatorios . La cantidad de atractylenolide I en 2.500 mg/kg de AME es de apenas 0,097 mg/kg, una dosis muy inferior a la mínima requerida. Además, durante la preparación de la AME debe haberse producido una pérdida de poliacetilenos. Es posible que la AME contenga compuestos similares a los glucocorticoides no identificados que contribuyan a su actividad antiinflamatoria sistémica.

Se necesita un número suficiente de células T para mantener una respuesta inmunitaria adecuada. En condiciones normales, el número total de células T se mantiene mediante la generación de células T ingenuas en el timo y el recambio de células T ingenuas periféricas y células T de memoria. Los ratones y los humanos sufren una atrofia del timo con la edad y, en consecuencia, la producción de células T ingenuas disminuye en ambas especies. Sin embargo, en cuanto al mantenimiento de las células T naïve, los ratones producen células T naïve durante toda su vida, mientras que los humanos adultos mantienen esta población mediante la división de células T naïve periféricas . Además, la vida útil de las células T ingenuas de los ratones es 40 veces más corta que la de sus homólogas humanas. Las células T de memoria se mantienen mediante una división intermitente. El mecanismo preciso de supervivencia y proliferación homeostática de las células T ingenuas y de memoria no está completamente definido, pero implica señales del complejo TCR/MHC y citoquinas como la IL-7 y la IL-15. El efecto prolongado de las vacunas depende de las células T de memoria, mientras que el tratamiento de las afecciones linfopénicas requiere células T ingenuas. No determinamos si la población esplénica de células T CD4 que aumentó tras el tratamiento con AME estaba formada por células T CD4 naïve o por células T CD4 de memoria. Una caracterización detallada de la fracción celular que responde a la AME ayudará a especificar qué situación es más adecuada para la aplicación de la AME.

De hecho, en el grupo de AME se produjo un aumento simultáneo de las moléculas MHC de clase II en el bazo. Las moléculas MHC de clase II son necesarias para proporcionar antígenos a las células T CD4. Hemos comprobado de forma rutinaria que la mayoría de las células que expresan MHC de clase II en el bazo son células B y las restantes son macrófagos y células dendríticas. No aclaramos qué tipos de células mostraban una regulación al alza de las moléculas del CMH de clase II tras la administración de AME. No obstante, el aumento tanto del número de células T CD4 como de la expresión de moléculas MHC de clase II en el bazo indica que la suplementación de AME contribuye al mantenimiento sistémico de las células T CD4. La función de la IL-4 en condiciones fisiológicas es potenciar la respuesta de los anticuerpos promoviendo la supervivencia y la proliferación de las células B y proporcionar defensa contra la infección por helmintos . Los esplenocitos de los grupos de AME mostraron una mayor producción de IL-4 durante la activación de las células T ex vivo, al mismo tiempo que disminuía la producción de IFN-γ. Estos resultados sugieren que, en condiciones normales, la AME promueve la respuesta Th2. Por el contrario, la administración oral de la glicoproteína derivada de la AM promueve la respuesta Th1 mientras que disminuye la respuesta Th2 en un modelo alérgico. No está claro si este compuesto representa toda la actividad de la AM. Se requieren más estudios para determinar si la AM previene o agrava las respuestas Th2 patológicas.

5. Conclusión

En este estudio, observamos cambios en las respuestas de los macrófagos y las células T en ratones normales tras la administración oral de AME. La AME mejoró la diferenciación de monocitos inducida por el tioglicolato en el peritoneo y suprimió los niveles de TNF-α e IL-6 inducidos por el LPS en el suero. A diferencia de estos efectos antiinflamatorios sistémicos, los efectos antiinflamatorios no fueron evidentes en los macrófagos aislados del grupo AME, excepto por las alteraciones en la expresión de moléculas costimuladoras. La AME también influyó en el sistema inmunitario adaptativo aumentando el número de células T CD4 y la expresión de moléculas MHC de clase II y promoviendo la respuesta Th2 sobre la respuesta Th1.

Abreviaturas

Disponibilidad de datos

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles a través del autor correspondiente, previa solicitud.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiada por el Ministerio de Educación (2014R1A1A2055052).