El área preóptica medial de los ratones es capaz de mediar en los comportamientos sexualmente dimórficos independientemente del género

Animales

Los animales C57BL/6J fueron adquiridos en el Jackson Laboratory, Slac Laboratory Animal (Shanghai) y criados en casa. Esr1-2a-Cre (Esr1Cre, #017913) y Vglut2-Ires-Cre (Vglut2Cre, #012569) se adquirieron del Jackson Laboratory. La línea Vgat-Cre (VgatCre) fue generada previamente68. Todas las líneas Cre se criaron en el fondo C57BL/6J durante al menos una generación. Los animales se alojaron en la instalación animal del Instituto de Neurociencia en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h con comida y agua ad libitum. Sólo se utilizaron en el estudio animales heterocigotos de alelos Cre. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Neurociencia, Academia China de Ciencias, Shanghái, China (IACUC Nº NA-016-2016).

Cirugía

Los ratones adultos de 2-4 meses de edad fueron anestesiados con isoflurano (0,8-5%) y colocados en un marco estereotáctico (David Kopf Instrument, Modelo 1900). Se aplicó una pomada oftálmica para evitar la deshidratación. Se expuso el cráneo con una pequeña incisión y se perforaron agujeros para inyectar el virus con pipetas de vidrio (15-25 μm de diámetro en la punta) y para implantar fibras ópticas. Las coordenadas para la inyección del virus en el mPOA fueron AP, -0,16 mm; ML, ±0,4 mm; DV, -5,150 mm (atlas del cerebro del ratón de Paxios y Franklin, 2ª edición). Se inyectaron 100-400 nl de virus por lado a un flujo de 70 nl por minuto utilizando un inyector casero de nanolitros o a 40 nl por minuto utilizando una bomba hidráulica (Harvard Apparatus). Las pipetas de vidrio se dejaron colocadas durante unos 10 minutos después de la inyección antes de retraerlas. Se colocaron fibras monoópticas (diámetro, 200 μm; A.N., 0,37; longitud, 6 mm; AniLab Software and Instruments Co., Ltd) o fibras ópticas duales (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT; Doric Lense) a 400 μm por encima del lugar de inyección del virus para los experimentos optogenéticos o a 50 μm por encima para los registros de fotometría de fibra. Las fibras ópticas se fijaron con cemento dental y tornillos de cráneo. Los compañeros de camada fueron elegidos al azar para ser inyectados con el virus experimental o el de control. Las cirugías de castración se realizaron con animales anestesiados con una inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (80 mg kg-1) y xilacina (8 mg kg-1). Se dejó que los animales se recuperaran durante 3-4 semanas después de las cirugías antes de las pruebas de comportamiento posteriores.

Virus

Ensayos de comportamiento

Todas las pruebas de comportamiento se iniciaron al menos media hora después del inicio del ciclo de oscuridad, y se grabaron utilizando una cámara de infrarrojos a una velocidad de fotogramas de 25 Hz y fueron puntuadas por experimentadores ciegos al genotipo, la información del grupo o el estado de fotoestimulación de los animales implicados. Todos los animales sometidos a pruebas de comportamiento, excepto los utilizados en los experimentos de inhibición optogenética, eran ratones vírgenes ingenuos antes de la prueba. En los experimentos de inhibición optogenética, todos los ratones machos fueron cohabitados con ratones hembra y algunos de ellos se convirtieron en padres antes de la prueba, mientras que algunas hembras fueron cohabitadas con crías, o apareadas para convertirse en madres, o tratadas con semanas de inyección de testosterona antes de la prueba. A excepción de los animales utilizados en los experimentos de activación optogenética, todos los animales fueron alojados individualmente entre 3 y 7 días antes de las pruebas de comportamiento.

Para las pruebas de comportamiento de apareamiento, se introdujo una hembra C57BL/6 ovariectomizada y cebada con hormonas en la jaula de la casa y se grabó en vídeo durante 30 minutos. Las pruebas de comportamiento de apareamiento se repitieron tres veces con diferentes animales de estímulo con al menos tres días de diferencia. El comportamiento parental se probó esparciendo tres crías de edades comprendidas entre P1 y P4 en el borde lejos del nido y grabando en vídeo al animal durante ~15 min y se repitió 2-3 veces. La agresión territorial se probó introduciendo un ratón intruso de mancha Balb/c comprado a Slac Laboratory Animal (Shanghai) en la jaula del animal probado y grabando en vídeo durante ~15 min.

Los vídeos se anotaron manualmente fotograma a fotograma utilizando un programa MATLAB escrito a medida como se ha descrito previamente8. Los comportamientos se puntuaron según los siguientes criterios: los contactos nariz-cara, nariz-cuerpo o nariz-urogenital iniciados por los animales experimentados se puntúan colectivamente como «investigación social», de los cuales el contacto nariz-urogenital se define específicamente como «quimioinvestigación», también conocido como «olfateo». La «monta» se puntúa cuando el animal de experimentación coloca sus extremidades delanteras sobre el lomo del estímulo, se sube encima y mueve la pelvis. Los movimientos pélvicos rítmicos después de la monta se puntúan como «empuje pélvico». Las acciones iniciadas por el residente hacia un intruso macho, incluyendo embestidas, mordiscos, volteretas, se puntúan como «Ataque». «Contacto con el cachorro» se puntúa cuando un animal contacta con un cachorro con su nariz o boca. «Recuperación del cachorro» se puntúa cuando un animal sujeta al cachorro con la boca y se desplaza, normalmente hacia el nido. «Agacharse» se puntúa cuando el animal arquea la espalda y se cierne sobre las crías en el nido. Los cachorros fueron siempre inspeccionados después del ensayo de comportamiento para detectar posibles heridas. Alrededor del 2% de los ensayos de comportamiento resultaron en cachorros heridos. La exclusión de estos ensayos no influyó en ninguna conclusión.

Activación optogenética

Los animales utilizados para los experimentos optogenéticos fueron alojados en grupo. El día de la prueba de comportamiento, se introdujeron en una jaula nueva. Se utilizó una fibra óptica externa para conectar una fuente de energía láser de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. o Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co., Ltd.) a la fibra óptica implantada en el animal. La fibra óptica externa se conectó a una junta giratoria (FRJ_1 × 1_FC_FC, Doric Lense) para que el animal pudiera comportarse libremente. Se dejó que el animal analizado explorara la jaula durante unos 15 minutos con la fibra externa conectada. Después, se puso en marcha un programa MATLAB personalizado para controlar un Master 9 (A.M.P.I.), que enviaba un disparador para iniciar la grabación desde la cámara y señales al láser para suministrar 15 s de fotoestimulación a 40 Hz 12 mW o 20 Hz 5 mW, espaciados 90-120 s al azar. La potencia del láser se ajustó para cada animal en función de la eficiencia de transitividad de la luminancia de la fibra óptica implantada, medida antes de la implantación para asegurar la potencia de la luz emitida en la punta de la fibra. Durante la estimulación con láser, los animales fueron sometidos a pruebas de locomoción solos, o con una hembra ovariectomizada cebada con hormonas, un macho C57BL/6, una rata joven de edad P13-P15, crías de edad P1-P4, o bloques de goma de tamaño similar a las crías como estímulo. Se administraron entre cinco y doce estímulos durante cada ensayo. Se realizaron uno-cuatro ensayos con cada estímulo (con un intervalo de 3-5 minutos) en un día determinado para cada animal. Después de completar todos los ensayos de comportamiento, los animales recibieron trenes de fotoestimulación (15 s, 12 mW, 40 Hz, 10 veces, un intervalo fijo de 105 s) y se perfundieron transcardialmente con paraformaldehído al 4% una hora después de la estimulación lumínica para el análisis histológico. También se recogió sangre en el momento de la matanza para realizar mediciones hormonales.

Fotometría de fibra

Los animales utilizados para los experimentos de fotometría de fibra fueron alojados individualmente de 3 a 7 días antes de las pruebas de comportamiento. Durante el día de la prueba, la fibra óptica implantada se conectó al F-scope (Biolink Optics Technology Inc., Pekín), un sistema integrado de registro de fotometría de fibra, a través de una fibra óptica externa. En el F-scope, un láser de excitación de 488 nm (OBIS 488LS; Coherent) se refleja en un espejo dicroico (MD498, Thorlabs). Las señales de emisión recogidas a través de la fibra óptica implantada se filtran con un filtro de paso de banda (MF525-39, Thorlabs) y se dirigen a un tubo fotomultiplicador (PMT, R3896, Hamamatsu). Durante los registros, la potencia del láser se ajustó para cada animal según la eficiencia de transitividad de la luminancia de la fibra óptica implantada para asegurar que la luz emitida en la punta de la fibra fuera de ~30 μw y la ganancia de voltaje del PMT se ajustó a 500 v para los animales GCamp6s y a 300-350 v para los animales de control. Una vez iniciado, el software F-scope envió una señal de disparo para iniciar la grabación de vídeo de la cámara de infrarrojos. Las señales de emisión se filtraron a 30 Hz y se muestrearon a 500 Hz con una tarjeta de adquisición de datos (USB6009, National Instrument) utilizando un software proporcionado por Biolink Optics. Para un ensayo determinado, primero se permitió a los animales explorar durante unos 5 minutos, tiempo durante el cual se registraron las señales de referencia. A continuación, se introdujo un estímulo, como una hembra ovariectomizada cebada con hormonas, un juguete de plástico falso para ratones, cachorros de edades comprendidas entre P1 y P4 o bloques de goma de tamaño similar al de los cachorros. Se permitió a los animales interactuar y comportarse con los estímulos durante 15-90 minutos antes de retirar los estímulos, tras lo cual se registraron las señales durante otros ~5 minutos.

Inhibición optogenética

Los animales utilizados para los experimentos de inhibición optogenética estaban alojados en solitario. Los ratones macho se alojaron junto con las hembras para que tuvieran experiencia sexual o se convirtieran en padres antes de las pruebas. Los ratones hembra vírgenes se sometieron a pruebas como animales ingenuos para el apareamiento típico de los machos y para los comportamientos maternos. En los casos en que los comportamientos maternos eran deficientes durante la prueba inicial, se las alojaba junto con las crías durante la noche y se las volvía a someter a pruebas de comportamiento materno. Después de las pruebas de comportamiento maternal, algunas hembras fueron tratadas cada dos días con una inyección subcutánea de testosterona (100 μg en 50 μl de aceite de girasol, Shanghai Pharm.) durante unas 3 semanas antes de ser probadas de nuevo para el apareamiento típico de los machos. Las hembras probadas como madres se aparearon después de la inyección viral para producir sus propias crías.

Antes de la prueba de comportamiento, se utilizó un cordón de parche de fibra óptica dual (DFP_200/230/900-0,37_1m_DF0,9_2FCM, Doric Lense) para conectar una fuente de energía láser de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century Co. o Changchun New Industries Optoelectronics Tech Co, Ltd.) a la fibra óptica dual implantada (DFC_200/245-0,37_6,0mm_DF0,9_FLT, Doric Lense) en el animal a través de una junta rotativa (FRJ 1 × 2i FC-2FC 0,22, Doric Lense) para permitir que el animal se comportara libremente. Tras unos 10 minutos de estancia, la cámara se activó para grabar el proceso de comportamiento mediante una señal enviada desde el Master 9, que fue controlada por un programa MATLAB escrito a medida. Para suministrar luz después de la aproximación, la luz (~12 mW) se activó automáticamente para ser suministrada de forma continua siempre que las posiciones del animal probado fueran detectadas por el programa para estar dentro de una longitud de cuerpo a la hembra ovariectomizada cebada hormonalmente en las pruebas de comportamiento de apareamiento o dentro de la región de la cría, que se definió marcando un área ligeramente más grande que rodea cada cría dispersa en las pruebas de comportamiento maternal. Se realizaron al menos dos ensayos con luz y dos ensayos sin luz alternativamente para cada prueba. Para emitir las luces después de la iniciación de los comportamientos definidos, se disparó manualmente una luz azul (~12 mW) de duración fija (5 o 10 s) cuando el experimentador observó el comportamiento de interés en tiempo real. Se realizaron uno o dos ensayos de luz alternativamente para cada prueba.

Inmunotinción fluorescente

Los animales fueron anestesiados con hidrato de cloral al 10% y perfundidos transcardialmente con PBS seguido de paraformaldehído (PFA) al 4% frío en PBS. Después, se seccionaron los cerebros a 40 μm de grosor utilizando un vibratomo (VT1000S, Leica). Las secciones se dividieron por igual en varios conjuntos y se procesaron para su tinción o se montaron directamente. Las secciones cerebrales se bloquearon en suero de cabra al 5% en AT (0,1% de Tritón y 2 mM de MgCl2 en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron durante toda la noche a 4 °C en AGT (0,5% de suero de cabra normal, 0.1% Tritón y 2 mM MgCl2 en PBS) que contenía el anticuerpo primario apropiado (conejo anti-c-Fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52; conejo anti-Esr154, 1:10.000, Millipore, Cat# 06-935). Al día siguiente, las secciones cerebrales se lavaron con AGT tres veces (30 minutos cada una) y se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados (Alexa Fluor 488 conjugado, 1:1000; Cy3 conjugado, 1:1000, Jackson ImmunoResearch) a temperatura ambiente durante 2 h. Las secciones cerebrales se contratinaron con Neuro Trace (Life Technologies, Cat# N21479, 1:300) o DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) en AT. Tras varios lavados en AGT, AT y PBS, las secciones de cerebro se montaron en portaobjetos de vidrio.

Tinción con DAB

Las secciones de cerebro se prepararon de forma similar a los experimentos de inmunotinción fluorescente y se pretrataron con H2O2 al 3% durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear la peroxidasa endógena, se lavaron dos veces durante 10 minutos cada una en PBST (0.3% Triton X-100 en PBS), se bloquearon con suero de cabra al 5% en PBST durante 2 h a temperatura ambiente y se incubaron con el anticuerpo primario anti-c-Fos (Rabbit anti-c-fos, 1:2000, Santa Cruz, Cat# sc-52) en PBST durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las secciones se lavaron seis veces en PBST, 10 minutos cada una, y luego se incubaron con el anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con biotina (Cat#111-065-003, Jackson ImmunoResearch) en PBST durante 2 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados en PBS, de 5 minutos cada uno, las secciones de cerebro se tiñeron con el reactivo VECTASTAIN® ABC durante 30 minutos siguiendo el manual del fabricante. Después de dos lavados de 5 minutos en PBS, las secciones de cerebro se incubaron en una solución de 3,3-diaminobenzidina (Cat# D5637-5G, Sigma) con intensificación de níquel hasta alcanzar la intensidad de tinción deseada. La reacción se detuvo enjuagando las secciones en agua del grifo. Las secciones del cerebro se montaron en portaobjetos de vidrio y se capturaron bajo objetivos ×4 o ×10 con microscopios de luz convencionales.

Hibridación in situ

Las plantillas de ADN para generar sondas in situ se clonaron utilizando los siguientes conjuntos de cebadores para cada gen correspondiente: Vgat, 5′-gccattcagggcatgttc-3′ y 5′-agcagcgtgaagaccacc-3′; Vglut2, 5′-atcgactagtccaaatctggtgctacctc-3′ y 5′-atcgctcgagtagccatctcctgttccact-3′; Cre, 5′- ccaatttactgaccgtacacca-3′ y 5′-tatttacggtccagccacc-3′; GAD1, 5′-cattgagatagaggttg-3′ y 5′-agagaagcgaaggctact-3′; Galanina, 5′-atcctgcactgaccagcc-3′ y 5′-ttggcttgagttggc-3′. Las sondas de ARN antisentido se transcribieron con ARN polimerasa T7 (Promega, Cat# P207E) y nucleótidos marcados con digoxigenina (DIG). Los animales fueron anestesiados con hidrato de cloral al 10% y perfundidos transcardialmente con PBS tratado con DEPC (D-PBS), seguido de paraformaldehído (PFA) frío al 4% en D-PBS. Posteriormente, se seccionaron los cerebros a 40 μm de grosor utilizando un vibratomo (VT1000S, Leica). Las secciones de cerebro se lavaron en tampón 2XSSC que contenía 0,1% de Tritón durante 30 minutos, se acetilaron en trietanolamina 0,1 M (pH 8,0) con 0,25% de anhídrido acético (vol/vol) durante 10 minutos, se equilibraron en solución de prehibridación durante 2 h a 65 ℃ y posteriormente se incubaron con 0,5 μg ml-1 de sondas de ARN específicas en tampón de hibridación durante la noche a 65 ℃. Al día siguiente, las secciones se enjuagaron en solución de prehibridación y prehibridación/TBST (TBS con 0,1% de tween-20) durante 30 min cada una. A continuación, las secciones se lavaron con TBST durante dos veces y TAE durante tres veces, cada una de ellas durante 5 min. A continuación, las secciones se transfirieron a pocillos en un gel de agarosa al 2%, que se pasaron en 1XTAE a 60 V durante 2 h para eliminar las sondas no hibridadas. Las secciones se lavaron dos veces en TBST, y posteriormente se incubaron con anti-digoxigenina-AP de oveja (1:2000, Roche, Cat# 11093274910), a veces junto con el anticuerpo anti-Esr1 de conejo (1:3000, Millipore, Cat# 06-935) para fines de co-tinción, en reactivo de bloqueo al 0,5% (Roche, 11096176001) a 4 °C durante la noche. El segundo día, para la tinción de campo claro se lavaron las secciones y se tiñeron con NBT (Roche, Cat# 11383213001) y BCIP (Roche, Cat# 11383221001) durante 4-10 h a 37 ℃. Para la hibridación in situ fluorescente combinada con la inmunohistoquímica, las secciones se tiñeron primero con anticuerpos secundarios fluorescentes, seguidos de la tinción con rojo rápido (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, Cat# 11758888001) y la contratinción con DAPI (5 mg ml-1, 1:1000, Sigma) en PBS. Todas las secciones se lavaron después de la tinción y se montaron en portaobjetos de vidrio. Las imágenes se capturaron con un objetivo ×20 utilizando un microscopio convencional o confocal.

catFISH

La mayoría de los animales utilizados en el experimento catFish eran experimentados. Para el procedimiento, se permitió a los animales dos episodios de 5 minutos de interacciones sociales con una hembra ovariectomizada cebada hormonalmente o con crías dispersas, con 30 minutos de diferencia. Inmediatamente después del segundo episodio, los animales fueron anestesiados con hidrato de cloral al 10% y perfundidos transcardialmente con DEPC-PBS seguido de PFA al 4% en PBS. Los cerebros se diseccionaron y se posfijaron durante la noche a 4 °C y se deshidrataron con sacarosa al 30% en DPEC-PBS. A continuación, se seccionaron los cerebros con un grosor de 20 μm y se montaron en portaobjetos SuperFrost Plus® (Fisher Scientific, nº de cat. 12-550-15). Tras el secado al aire, los portaobjetos se almacenaron a -80 °C antes de ser procesados de acuerdo con el manual de usuario del RNAscope® Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 (ACD Bio.). Las sondas contra el intrón de c-Fos, el ARNm de c-Fos y Esr1 se pidieron a ACD Bio. y se utilizaron en el experimento. Las imágenes se capturaron con un objetivo ×60 utilizando un microscopio confocal.

Registros electrofisiológicos

Los animales C57BL/6 inyectados con AAVs que codifican ChR2-mCherry en el mPOA o los ratones Esr1Cre inyectados con AAVs que codifican GtACR1 fueron anestesiados con isoflurano y perfundidos transcardialmente con solución oxigenada helada (95% O2/5% CO2) de alto contenido en sacarosa (composición en mM: 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 2 Na2HPO4, 2 MgSO4, 213 sacarosa, 26 NaHCO3). Tras la disección del cerebro, se cortaron secciones coronales que incluían el mPOA a 250 μm utilizando un vibratomo (VT-1200S, Leica) en solución de corte oxigenada helada. A continuación, los cortes de cerebro se incubaron en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF; composición en mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,25 Na2HPO4, 2 MgSO4, 10 glucosa, 26 NaHCO3, 2 CaCl2) a 34 °C durante al menos 1 hora y se registraron a temperatura ambiente. Las células se identificaron con un microscopio fluorescente y se visualizaron mediante contraste de interferencia diferencial infrarrojo (BX51, Olympus). Los registros de pinzas de corriente de células enteras se realizaron con un amplificador MultiClamp700B y una interfaz Digidata 1440A (Molecular Devices). El electrodo de patch-clamp (5-8 MΩ) se rellenó con una solución intracelular (composición en mM: 120 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 10 fosfocritina sódica, 4 Mg-ATP y 0,3 Na3-GTP, pH:7,3, 265 mOsm). Para la activación optogenética, se administró luz azul (473 nm, 10 ms de ancho, 14 mw mm-2, 40 pulsos) sobre los cortes a través de un objetivo ×40 utilizando una fuente de luz LED X-Cite (Lumen Dynamics). La fidelidad de los picos en las neuronas que expresan ChR2 se midió contando el número de pulsos de luz que evocaron con éxito potenciales de acción a diferentes frecuencias. La fidelidad de los picos se promedió a lo largo de cinco estimulaciones y se representó gráficamente. Para la inhibición optogenética, el potencial de acción de las neuronas que expresan GtACR1 se indujo reteniendo el potencial de membrana -48 mW con una inyección de corriente y se administró luz azul continua repetida en los cortes.

Imagen de calcio en cortes de cerebro

Los AAVs que codifican ChR2 y los AAVs que codifican GCamp6s, ambos impulsados por hSyn, se co-inyectaron en el mPOA de animales C57BL/6. Se prepararon cortes cerebrales agudos que incluían el mPOA de forma similar a los procedimientos electrofisiológicos descritos anteriormente. Las imágenes de calcio se llevaron a cabo utilizando un microscopio de escaneo láser de dos fotones (Ultima, Prairie Instruments Inc.) con un objetivo de inmersión en agua 20X/0,95-NA XLUMPLFL (Olympus). El láser Ti:sapphire se sintonizó a 940 nm, y se adquirieron imágenes de 512 × 512 píxeles a través de un filtro de emisión de 525/70 nm a una frecuencia de cuadro de 1,2 Hz. Se administraron trenes aleatorios de luz de 470 nm (pulso de 10 ms, 15 s, 8,4 mW mm-2) de diferentes frecuencias (10 Hz, 20 Hz, 40 Hz) a los cortes con intervalos de ~2 min. Las imágenes se analizaron utilizando ImageJ.

Ensayos hormonales

Se recogió sangre del tronco en el momento de la matanza antes de la perfusión. Se preparó el suero. Los títulos hormonales se analizaron utilizando un kit ELISA de testosterona (DRG Instruments GmbH, Alemania, División de ARG international, Inc, Cat# EIA-1559) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Análisis de datos

Todos los códigos se escribieron en MATLAB y se utilizaron para el análisis de datos, y están disponibles a petición. No se realizó ningún cálculo del tamaño de la muestra. El número de células registradas en el corte o contadas en la tinción y el número de animales utilizados para las pruebas de comportamiento y la tinción se eligieron de acuerdo con la literatura publicada de experimentos similares. Se excluyeron del análisis los puntos de datos de los animales que, tras un análisis histológico post hoc, se consideraron erróneos según criterios preestablecidos. En total, se excluyeron del análisis tres ratones Esr1Cre hembra y un ratón Esr1Cre macho inyectados con GtACR1, un ratón VgatCre macho y hembra y un ratón Esr1Cre hembra inyectado con Casp3.

Para analizar los datos de los experimentos de obtención de imágenes de Ca2+ en cortes de cerebro, se cuantificaron las imágenes en ImageJ. Brevemente, las células GCaMP6s+ se perfilaron manualmente y se calcularon los cambios de fluorescencia relativos (ΔF/F) para cada célula con la ecuación ΔF/F = (F-F0)/F0, en la que F0 es la intensidad media de los píxeles en los últimos 10 fotogramas antes de la fotoestimulación y F es la intensidad media de los píxeles en los primeros 6 fotogramas después de la fotoestimulación. Las imágenes adquiridas durante los períodos de fotoestimulación se excluyeron del análisis. Una célula activada se definió operativamente como las células que mostraban un aumento de ΔF/F que se alejaba 5 desviaciones estándar de los valores medios de ΔF/F medidos en 30 fotogramas antes de la primera fotoestimulación.

Para analizar la locomoción evocada por la luz, se extrajeron primero las trazas de movimiento utilizando códigos personalizados de MATLAB, que reconocen el centroide de un animal. A continuación, se calculó la velocidad de movimiento en intervalos de tiempo de 1 s midiendo la distancia recorrida. Los 15 puntos de datos de velocidad de movimiento durante un periodo de fotoestimulación se compararon con los 15 puntos anteriores para comprobar si esa estimulación lumínica inducía un aumento de la velocidad en ese ensayo. A nivel del animal, los promedios de las velocidades de movimiento durante cada período de fotoestimulación se compararon con los promedios de las velocidades de movimiento inmediatamente anteriores a cada período de fotoestimulación para determinar si la locomoción inducida por la luz aumenta en ese animal. Para el montaje inducido por optogenética y la recuperación de las crías, los vídeos se puntuaron primero a ciegas. A continuación, se alinearon los registros de vídeo con los registros de fotoestimulación para extraer el porcentaje de ensayos, la latencia de inicio y la duración total de los comportamientos evocados. Sólo los comportamientos que se produjeron durante la estimulación lumínica se contaron como comportamientos inducidos optogenéticamente. Si un comportamiento se producía antes de un periodo de fotoestimulación, pero sin embargo se producía durante el mismo, dicho comportamiento no se contabilizaba como comportamiento inducido optogenéticamente. Los parámetros se promediaron siempre a través de los períodos de fotoestimulación en el mismo ensayo de comportamiento y luego a través de los ensayos si había múltiples. Para trazar la distribución temporal de las conductas optogenéticamente evocadas, sólo se utilizaron para promediar los períodos de fotoestimulación en los que se produjeron las conductas. En los ensayos de comportamiento con un macho, se utilizó una rata joven o falsas crías como estímulo o cuando los animales ChR2 fueron castrados, se compararon los comportamientos inducidos optogenéticamente con los comportamientos espontáneos que se produjeron en el periodo de 15 s inmediatamente anterior a los periodos de fotoestimulación.

Para analizar el efecto de la inhibición optogenética en un comportamiento específico, los vídeos se puntuaron primero a ciegas. A continuación, los registros de vídeo se alinearon con los registros de fotoestimulación para extraer los eventos de comportamiento que se encontraron con la estimulación de la luz. Para trazar varios parámetros de comportamientos específicos, los eventos de comportamiento que se encontraron con el estímulo de la luz se promediaron en el nivel de ensayo si existían múltiples ensayos y luego en el nivel del animal. Para trazar la distribución de acumulación de comportamientos específicos, sólo se analizaron los eventos de comportamiento que se encontraron con la estimulación de la luz.

Para simular un centro de activación para un animal ChR2, se recortó un área de 1100×1500 μm con un lado cerca de la línea media y el lado perpendicular cerca de la parte inferior del cerebro de cada sección coronal del cerebro y se redimensionó a 1 μm por píxel. Las señales de c-Fos en cada 100×100 μm se extrajeron de forma semiautomática utilizando el programa MATLAB junto con ImageJ y se sumaron en una matriz de 11 × 15 según sus ubicaciones dentro de cada sección. El número medio de células NeuN/HuCD+ dentro de un cuadrado de 100 μm2 se estimó en ~25. Para calcular las coordenadas del centro de activación a lo largo del eje lateral-medial y dorsal-ventral, se promediaron los números dentro de la matriz de 11 × 15 en una serie de secciones cerebrales que abarcaban la parte anterior y posterior de cada animal y se ajustaron con una función gaussiana de dos dimensiones en MATLAB. Para calcular la coordenada anterior-posterior del centro de activación, se sumó el número total de c-Fos para cada sección del cerebro y se ajustó con una función gaussiana única.

Para los experimentos de fotometría de fibra, las señales de fluorescencia en bruto se ajustaron además según la tendencia general para tener en cuenta el fotoblanqueo. Se excluyeron del análisis posterior los ensayos con fluctuaciones, ondas cuadradas de las señales o de una relación señal/ruido extremadamente baja. Para la respuesta inicial, los valores de cambio de fluorescencia (ΔF/F) se obtuvieron calculando (F-F0)/F0, donde F0 es la mediana de la señal de fluorescencia de la línea base. Para las señales de fluorescencia alineadas con los comportamientos, los datos se segmentaron basándose en los eventos de comportamiento dentro de los ensayos individuales y se utilizaron como F0 las señales medias de 10-15 s antes del inicio del comportamiento. Para analizar la importancia estadística de las dos señales de fluorescencia relacionadas con los eventos, se utilizó la prueba t con una tasa de falsos descubrimientos (FDR) de 0,05. Para correlacionar los transitorios de Ca2+ y los comportamientos, se contó un evento de Ca2+ en rampa cuando los valores de ΔF/F eran 3 desviaciones estándar por encima de la línea de base y duraban más de 2 s. El número de eventos de Ca2+ se contó entre el primer y el último comportamiento y se correlacionó con el número de eventos de comportamiento durante ese periodo. Sólo se utilizaron para el análisis de correlación los ensayos conductuales que tenían más de dos montajes y más de una recuperación.

Las imágenes histológicas se capturaron con un objetivo ×20 en un microscopio confocal a menos que se especifique lo contrario. Las imágenes se procesaron y contaron en ImageJ con códigos MATLAB escritos a medida. Todos los recuentos fueron realizados por experimentadores ciegos al sexo o a la condición de prueba del animal. Para analizar la expresión viral de ChR2, se contó manualmente el co-etiquetado de ChR2, c-Fos y Nissl en el área de inyección central. Para analizar el co-etiquetado de Esr1 y Vglut2, Vgat o Galanin, se seleccionaron cinco áreas relativamente fijas en cinco secciones del cerebro de posiciones similares para contarlas manualmente. Para comprobar la especificidad de la expresión de Cre en los animales Esr1-cre, se contó manualmente el co-etiquetado de Esr1 y Cre en varias áreas de múltiples cortes obtenidos de un animal. Para cuantificar las imágenes de los experimentos de catFISH, que se tomaron con un objetivo ×60, se reconocieron las células positivas para c-Fos citoplasmático o nuclear y para Esr1 con DAPI como contratinción y se contaron manualmente. Para cuantificar los efectos de la ablación viral de las neuronas Esr1+, se contaron las señales Esr1+ en el mPOA, tal y como se define en el Allen Brain Atlas, para ambos lados, utilizando estereología no sesgada con el software Stereo Investigator (MBF bBioscience). En concreto, utilizando una sonda de fraccionador óptico, se enumeraron las señales Esr1+ en una caja de recuento de 30×30 μm dentro de una cuadrícula de muestreo de 100×100 μm. Para cuantificar los efectos de la ablación viral de las neuronas Vgat+ o Vglut2+, se tomaron imágenes de secciones cerebrales con objetivo ×10 mediante el Olympus VS120. Las áreas que se tiñeron con señales Vgat+ o Vglut2+ dentro del mPOA y las regiones adyacentes se extrajeron de forma semiautomática utilizando códigos de MATLAB.

Estadística

En los gráficos de barras, los datos se presentan como media ± s.e.m. En los gráficos de caja y bigotes, los datos se presentan como bigotes de mínimo a máximo y la media se indica con «+» y la mediana con una línea horizontal. A menos que se especifique lo contrario, se realizaron las siguientes pruebas estadísticas y todas las pruebas se especificaron como de dos caras. Los datos categóricos se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher. Los datos emparejados se analizaron mediante la prueba de pares. Para analizar la diferencia estadística de la distribución de la acumulación, se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras. Los datos con una variable independiente se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc con la corrección de Bonferroni. Los datos con dos variables independientes se analizaron mediante ANOVAs de dos vías seguidos de una prueba post hoc con corrección de Bonferroni. Para otras comparaciones, se comprobó la distribución de los datos con la prueba de normalidad de Lilliefors. Si los datos superaban la prueba de normalidad, se utilizaba la prueba paramétrica (prueba t de Student). En caso contrario, se utilizó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon. El valor p y el coeficiente de correlación de Pearson se calcularon utilizando una distribución t de Student para una transformación de la correlación. *p < 0,05, **p ≤ 0,01, ***p < 0,001.

Disponibilidad de datos

Todos los datos de este estudio están disponibles bajo petición.