Ensayo clonogénico: qué, por qué y cómo

Un ensayo clonogénico, también conocido como ensayo de formación de colonias

es un ensayo de supervivencia celular in vitro. Evalúa la capacidad de las células individuales de sobrevivir y reproducirse para formar colonias.1 Este ensayo se describió por primera vez en la década de 1950, donde se utilizó para estudiar los efectos de la radiación en la supervivencia y el crecimiento de las células cancerosas y, posteriormente, ha desempeñado un papel esencial en la radiobiología.2

Para medir la clonogenicidad, es necesario sembrar las células a densidades muy bajas y dejarlas durante un período de 1 a 3 semanas para que se formen las colonias. A continuación se fijan las colonias, se tiñen con violeta de cristal para hacerlas visibles y se cuentan. Se trazan curvas de supervivencia celular para analizar los datos. Hoy en día, los ensayos clonogénicos se utilizan para responder a una variedad de preguntas experimentales, especialmente en la biología del cáncer.

Este blog destaca:

Cómo realizar un ensayo clonogénico con consideraciones importantes a tener en cuenta a lo largo del camino

El uso de la microscopía sin etiquetas y la detección de confluencia para evaluar el recuento y el tamaño de las colonias mediante la cuantificación automatizada de imágenes

El ensayo de supervivencia clonogénica

Los ensayos clonogénicos se utilizan ampliamente en el campo de la investigación del cáncer, ya que la formación de clones se interpreta como un rasgo de las células cancerosas con capacidad para iniciar un tumor. Aunque este ensayo se utilizó inicialmente en el campo de la radiobiología, se ha convertido en una herramienta estándar en la investigación del cáncer para evaluar el crecimiento celular y los efectos citotóxicos o genotóxicos de varios agentes con potencial aplicación clínica. Esto incluye a los agentes quimioterapéuticos y a las terapias dirigidas por sí solas o en combinación 3.

El crecimiento clonogénico también se utiliza para evaluar el carácter de células madre de determinadas poblaciones celulares, ya que las células madre son células de larga vida con el potencial de proliferación continua. Esto es especialmente relevante para la investigación del cáncer, ya que las células madre cancerosas suelen estar asociadas a la quimiorresistencia, la formación de tumores secundarios y la recurrencia del cáncer. Por lo tanto, investigar la capacidad de las células madre del cáncer mediante un ensayo clonogénico es una herramienta valiosa y ampliamente utilizada para predecir la eficacia de una terapia concreta.4

Los ensayos clonogénicos miden la capacidad de las células para conservar su integridad reproductiva durante un periodo de tiempo prolongado. Esta es una característica importante ya que revela los efectos fenotípicos que requieren tiempo y posiblemente varias divisiones celulares para desarrollarse. Cuando se analiza la resistencia terapéutica, esto es especialmente importante. La resistencia a los fármacos no puede identificarse mediante ensayos de citotoxicidad a corto plazo.5

Cómo realizar un ensayo clonogénico

La información de esta sección se ha adaptado de Franken et al. (2006), que publicaron un protocolo de ensayo clonogénico en Nature Protocols1, combinado con algunas ideas de mi propia experiencia obtenida al realizar más de 60 ensayos clonogénicos durante mi doctorado.

Esencialmente, hay dos formas diferentes de realizar un ensayo clonogénico:

(1) Las células pueden ser sembradas a bajas densidades y luego tratadas para examinar el efecto del tratamiento en la clonogenicidad de las células.

(2) Las células pueden tratarse durante un período determinado y luego volver a sembrarse a bajas densidades en medios sin tratamiento para examinar la capacidad clonogénica.

Esto último se utiliza a menudo para evaluar la resistencia terapéutica después del tratamiento. La figura 1 resume el primer enfoque, que es el método tradicional para realizar un ensayo clonogénico. Como quedará claro, se trata de un método que consume mucho tiempo y que no proporciona información sobre la progresión del experimento (sólo punto final). Más adelante hablaremos de los métodos alternativos automatizados y sin punto final.

Protocolo tradicional para ensayos clonogénicos

Figura. 1 | Un resumen de un protocolo clonogénico tradicional en el que las células se siembran, se tratan y luego se evalúa la clonogenicidad.

Los ensayos clonogénicos se realizan normalmente en placas de 6 o 24 pocillos. Las células tienen que estar chapadas de forma dispersa y uniforme para que se puedan formar colonias aisladas. Por lo tanto, es importante optimizar la densidad de siembra para el tamaño de pozo elegido antes de realizar el ensayo clonogénico.

Un buen punto de partida es buscar en la literatura para ver si algún estudio ha realizado ensayos clonogénicos con su línea celular y luego probar esta densidad de siembra y otras dos o tres. Durante este proceso de optimización, también es importante tener en cuenta el punto final del experimento (por ejemplo, 7 días, 14 días o 21 días) y la tasa de crecimiento celular, ya que no se desea que las colonias se fusionen, lo que interferirá con la cuantificación y el análisis de las colonias. Las densidades de siembra deben ser las mismas para todas las condiciones de tratamiento dentro de su experimento.
Utilizar los controles adecuados es fundamental para la etapa de análisis. Siempre se debe utilizar un control sin tratar, así como un control sólo con vehículo (puede ser DMSO, PBS o cualquier disolvente en el que se disuelva el tratamiento). Para las condiciones de tratamiento, se suele utilizar una serie de diluciones. El período de tratamiento y la dureza de su tratamiento ayudarán a determinar su rango de concentración – esto es probable que requiera cierta optimización. Cada condición de control y experimental debe realizarse por triplicado.

Durante la fase de formación de la colonia, deberá supervisar el crecimiento de la misma en todas las condiciones de tratamiento. Se considera que una colonia es de 50 células o más y sólo son visibles bajo el microscopio. Como este ensayo suele ser de larga duración, deberá cambiar el medio celular. Las células estarán en una confluencia muy baja para empezar, por lo que no necesitará cambiar los medios con la regularidad habitual. Sin embargo, si está sembrando y luego tratando con un fármaco o compuesto, es importante tener en cuenta su vida media y añadir tratamiento fresco según sea necesario.

Para los investigadores que estén interesados en obtener imágenes del crecimiento de la colonia a lo largo del tiempo. Recomendamos mirar el CytoSMART Omni.

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A menudo son las colonias bajo las condiciones de control las que crecen más rápido y, por lo tanto, puede utilizar estas células como indicación de su punto final experimental, es decir, termine el experimento antes de que sus colonias empiecen a fusionarse y, si esto ocurre demasiado rápido, utilice una densidad de siembra menor para su experimento. Es importante terminar el experimento para todas las condiciones de tratamiento al mismo tiempo.

Una vez que haya alcanzado el punto final del experimento, las células deben lavarse suavemente con PBS (añada el PBS al lado del pozo para no interrumpir las colonias), fijarse y teñirse con el tinte intercalante de ADN, violeta de cristal (0,5% p/v) durante al menos 30 minutos. Retirar el exceso de tinte puede ser complicado. La mejor técnica es sumergir suavemente las placas en vasos de precipitados sumergidos en agua hasta que se haya eliminado todo el exceso de tinte y sólo queden colonias de color púrpura brillante. Las colonias teñidas pueden contarse hasta 50 semanas después de la tinción. Para ayudar a los investigadores en el análisis y la optimización de sus ensayos de formación de colonias, CytoSMART ha introducido una aplicación para el CytoSMART Omni que permite detectar las colonias en imágenes (time-lapse) de placas de pocillos enteras con un aumento de 10X. Las imágenes de lapso de tiempo en incubadora pueden proporcionar información cinética en lugar de un punto final, lo que puede proporcionar información más detallada sobre cuándo el tratamiento comienza a afectar a las células. El análisis de imágenes sin etiquetas se utiliza para detectar colonias, evaluar su tamaño y circularidad. Se puede determinar con precisión cuándo las colonias empiezan a fusionarse y optimizarlas en consecuencia.

Cómo analizar su ensayo clonogénico

Realmente es tan sencillo como contar manualmente sus colonias para cada condición de tratamiento y representar los datos como una curva de supervivencia (debe utilizar al menos tres repeticiones biológicas para su curva).

Una curva de supervivencia requiere que se calcule la fracción superviviente (SF) de las células tratadas (esto incluye una relación entre las colonias formadas y las células sembradas) y se represente frente a la dosis de tratamiento. Antes de poder calcular la SF, es necesario determinar la eficiencia de siembra (PE) de sus células, ya que diferentes líneas celulares tienen diferentes eficiencias de siembra y esto afecta al cálculo de la fracción de supervivencia.

PE es la relación entre el número de colonias y el número de células sembradas en sus células no tratadas1. La figura 1 muestra las fórmulas PE y SF y un ejemplo de curva de supervivencia.

El recuento manual de las colonias es tedioso y puede ser propenso a los sesgos, por lo que se han desarrollado una serie de herramientas de análisis de imágenes informatizadas disponibles gratuitamente para analizar las imágenes de los ensayos clonogénicos de forma rápida y objetiva. Una mención digna es el paquete de software disponible gratuitamente desarrollado por Brzozowska et al. (2019) que no solo cuenta las colonias, sino que también traza sus distribuciones de tamaño, lo que constituye otra capa de información útil sobre el comportamiento celular (véase la figura 2a).6

Una alternativa al recuento y la cuantificación de las colonias individuales, es la determinación del porcentaje del área del pozo que está cubierto por las colonias (porcentaje de área de la colonia) para cuantificar el crecimiento celular clonogénico. Guzmán et al. (2014) desarrollaron un plugin de ImageJ disponible gratuitamente llamado ColonyArea que hace precisamente esto (véase la figura 2b).7Esta es una herramienta útil para usar si tiene colonias fusionadas que son difíciles de contar a ojo o por el software de recuento de colonias o si desea un método de análisis rápido y de alto rendimiento.

Figura. 2 | Herramientas de medición de ensayos clonogénicos de libre acceso. (A) Brzozowska et al. desarrollaron un software (countPHICS) que cuenta las colonias y mide el tamaño de las mismas.6 (B) Guzmán et al. desarrollaron un plugin de ImageJ, ColonyArea, que cuantifica el área de crecimiento de las colonias y la intensidad de la tinción.7

Protocolo de ensayo clonogénico semiautomatizado, sin etiqueta y sin punto final

Un artículo reciente de Mayr et al. (2018), describe un protocolo de ensayo clonogénico nuevo y modificado que utiliza un formato de microplaca de 96 pocillos y detección de confluencia para medir las colonias. Este método permite configuraciones experimentales completas utilizando una placa de 96 pocillos, es libre de etiquetas, no tiene punto final de tinción y el análisis es semiautomático (figura 3)8. Además, la medición de confluencia sin punto final y resuelta en el tiempo del mismo pozo mostró que el análisis semiautomático era adecuado para determinar el número de colonias y el tamaño medio.

Figure. 3 | Mayr et al. evaluaron el crecimiento clonogénico en el formato de 96 pocillos a lo largo del tiempo utilizando la detección de confluencia8. El gráfico muestra la cuantificación del crecimiento clonogénico en diferentes puntos de tiempo y las imágenes muestran pozos específicos con detección de confluencia. Los puntos verdes representan áreas detectadas por un lector de confluencia y las flechas naranjas indican colonias fusionadas.

Este método de ensayo clonogénico proporciona una alternativa rentable y en tiempo al protocolo de ensayo clonogénico estándar. Al no requerir la fijación y tinción del punto final, este protocolo permite la supervisión y el análisis continuos del crecimiento clonogénico. Además, durante el experimento también se pueden extraer métricas adicionales sobre la cinética del crecimiento de las colonias. El formato miniaturizado también abre la oportunidad de probar tratamientos costosos como las terapias basadas en siRNA o CRISPR/Cas9 que no serían factibles con el volumen de tratamiento requerido para una placa de 6 o 24 pozos. En definitiva, Mayr et al. demostraron que la microscopía sin etiquetas con detección de confluencia es una opción robusta y viable para medir la clonogenicidad.

Una solución sin etiqueta, sin punto final y automatizada para sus ensayos clonogénicos es el CytoSMART Omnicon su algoritmo de detección de colonias. La formación de colonias se mide a lo largo del tiempo en todo un pozo con lecturas de recuento de colonias, tamaño y circularidad. Sus células no tienen que salir de la incubadora y se puede obtener información cinética celular durante el proceso de formación de colonias (figura. 4).

Figura 4 |Detección automatizada de colonias utilizando el CytoSMART Omni. Las células de cáncer de hígado HEP-G2 en una placa de 24 pocillos fueron fotografiadas durante 75 horas utilizando el CytoSMART Omni que se mantiene dentro de una incubadora estándar de CO2. La imagen muestra un pozo lleno después de ejecutar el algoritmo de detección de colonias con grupos de células resaltados por la máscara de colonias naranja. El recuento de colonias, el tamaño y la circularidad se midieron durante la duración del ensayo y se muestran en los gráficos.

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