Con el fin de demostrar el uso de Escher-FBA para aplicaciones reales, presentamos cuatro ejemplos clave de FBA que se pueden ejecutar directamente en el navegador. Estos son adaptados de una revisión de FBA y sus aplicaciones . Estos ejemplos se basan en el modelo central predeterminado de E. coli, por lo que están listos para ser implementados tan pronto como se abra la página web de Escher-FBA. Asegúrese de hacer clic en el botón Reset Map entre cada ejemplo. Si tiene problemas para encontrar una reacción, simplemente haga clic en la opción Buscar del menú Ver (o en la tecla «f» de su teclado) para abrir una barra de búsqueda.
FBA con sustratos de carbono alternativos
El primer ejemplo demuestra el uso de FBA para predecir si el crecimiento puede ocurrir en sustratos de carbono alternativos. El modelo central por defecto de E. coli incluye un medio mínimo simulado con D-glucosa como fuente de carbono. Aquí, cambiaremos la fuente de carbono de D-glucosa a succinato. En primer lugar, pase el ratón por encima de la reacción de intercambio de succinato EX_succ_e, y cambie el límite inferior a – 10 mmol/gDW/hora, ya sea arrastrando el control deslizante o introduciendo – 10 en el campo Límite inferior. A continuación, pase el ratón sobre la reacción de intercambio de D-glucosa EX_glc_e, y aumente el límite inferior a 0 o haga clic en el botón Knockout. El objetivo por defecto sigue siendo maximizar el crecimiento, por lo que estos dos cambios indicarán al programa que calcule la tasa máxima de crecimiento utilizando succinato como fuente de carbono en lugar de D-glucosa. Debería ver que la tasa de crecimiento máxima prevista disminuye de 0,874 h- 1 a 0,398 h- 1, lo que refleja el menor rendimiento de crecimiento de E. coli con succinato (Fig. 2a). Este es el enfoque general para realizar cambios en Escher-FBA; pase el ratón sobre la reacción, realice los cambios necesarios y Escher-FBA mostrará automáticamente sus resultados. Los valores del límite inferior para el intercambio de fuentes de carbono representan mediciones experimentales, por lo que puede intentar ajustar el valor del límite inferior específico a valores realistas para el crecimiento en otras fuentes de carbono.
Ejemplos de simulaciones Escher-FBA. (a) Crecimiento simulado con succinato como única fuente de carbono. (b) Crecimiento anaeróbico simulado en un medio mínimo de glucosa. (c) Maximización del rendimiento de ATP en el modelo por defecto. (d) Crecimiento del modelo iMM904 de S. cerevisiae. Tenga en cuenta que los anchos de las flechas se aumentaron en el menú de configuración para hacer los cambios más obvios
FBA durante el crecimiento anaeróbico
El crecimiento anaeróbico se puede simular de la misma manera al pasar el ratón sobre la reacción EX_o2_e y hacer clic en Knockout o cambiar el límite inferior a 0. Si cambia el intercambio de oxígeno a cero mientras el succinato sigue siendo la única fuente de carbono, el indicador Flux Through Objective muestra «Infeasible solution/Dead cell», lo que significa que el crecimiento no es posible. Intente hacer clic en el botón Reset en la esquina inferior derecha para simular un medio mínimo con D-glucosa como fuente de carbono, luego elimine EX_o2_e, y la tasa de crecimiento prevista debería ser de 0,211 h- 1 (Fig. 2b).
FBA con objetivos compuestos
Escher-FBA admite la configuración de múltiples objetivos en el modo de objetivos compuestos. En el modelo por defecto, el establecimiento de un nuevo objetivo siempre desactiva el objetivo anterior. Para habilitar el modo, primero haga clic en el botón de Objetivos Compuestos en la parte inferior de la pantalla. Como ejemplo de uso del modo: para comprobar la tasa de crecimiento máxima mientras se minimiza el flujo a través de SUCDi, comience con el objetivo por defecto de maximizar la producción de biomasa. A continuación, pase el ratón por encima de la etiqueta de reacción para SUCDi y haga clic en el botón Minimizar dentro de la información sobre herramientas. En la parte inferior derecha, debería ver ambos objetivos listados. Tenga en cuenta que actualmente sólo se admiten coeficientes de objetivos de 1 o – 1 (representados por Maximizar y Minimizar). Para volver a los objetivos individuales, sólo tiene que hacer clic en el botón Objetivos compuestos de nuevo.
Análisis de los rendimientos metabólicos
También podemos utilizar Escher-FBA para determinar los rendimientos máximos de precursores y cofactores como el ATP. Todo lo que se requiere es una reacción equilibrada estequiométricamente que consuma el cofactor de interés. La reacción de mantenimiento del ATP (ATPM) es un ejemplo de ello. Para determinar la máxima producción de ATP, simplemente pase el ratón sobre la reacción ATPM y haga clic en el botón Maximizar. Configurar el objetivo de esta manera funciona porque, para que el sistema maximice el flujo a través de la reacción ATPM, primero debe producir ATP en la mayor cantidad posible. Cuando se maximiza el ATPM en el modelo de metabolismo central por defecto de E. coli, el valor objetivo es de 175 mmol/gDW/hora. (Fig. 2c). Con succinato como fuente de carbono, este valor disminuye a 82,5 mmol/gDW/hora. Este mismo procedimiento puede seguirse para cualquier metabolito de interés creando una reacción de consumo equilibrada estequiométricamente y ajustando el modelo para maximizar el flujo a través de esa reacción. Tenga en cuenta que actualmente no es posible crear tal reacción automáticamente en Escher-FBA, pero esto puede ser añadido a una futura versión.
Análisis de la variabilidad del flujo
El análisis de soluciones óptimas alternativas en el metabolismo es otra aplicación útil de FBA . Dado que las soluciones producidas mediante FBA a menudo no son únicas, puede ser útil conocer el rango de valores de flujo que puede tener una reacción concreta. El análisis de variabilidad de flujos (FVA) se utiliza a menudo para calcular estos rangos en toda la red. Escher-FBA no soporta los cálculos de FVA directamente, pero es posible calcularlos para una reacción determinada. Para ello, primero pase el ratón por encima de la función objetivo (la reacción de biomasa Biomass_Ecoli_core_w_GAM) y establezca los límites superior e inferior en un valor ligeramente inferior al del flujo actual (en el mapa por defecto, pruebe con 0,870). A continuación, pase el ratón sobre una reacción de interés y haga clic en los botones Maximizar y Minimizar para ver el flujo máximo y mínimo a través de esa reacción dada la tasa de crecimiento óptima. Por ejemplo, al maximizar y minimizar el flujo a través de GAPD en la glicólisis se obtiene un rango de flujo factible de 15.44-16.68 mmol/gDW/hora, lo que indica que el flujo glicolítico está altamente restringido a altas tasas de crecimiento. Por otro lado, maximizar y minimizar el flujo a través de MALS en la derivación de glioxilato produce un rango de flujo factible de 0-2,64 mmol/gDW/hora, indicando que la derivación de glioxilato puede estar activada o inactiva a altas tasas de crecimiento. Este procedimiento puede realizarse con cualquier conjunto de reacciones y el usuario puede restringir su sistema a cualquier número de valores de flujo para ver el rango de soluciones disponibles para una reacción en particular.
Usando otros modelos a escala de genoma
El modelo central de E. coli por defecto no es el único sistema que puede ser simulado. Por ejemplo, si se desea realizar simulaciones en una célula de levadura, se puede descargar un modelo y un mapa para Saccharomyces cerevisiae en http://bigg.ucsd.edu/models/iMM904. En esa página, haga clic en el botón de descarga para el modelo (iMM904.json) y el mapa (iMM904.Central carbon metabolism.json). Cárguelos en Escher-FBA haciendo clic en Cargar mapa JSON en el menú Mapa y en Cargar modelo JSON en el menú Modelo para cargar ambos archivos JSON. Una vez cargado, el mapa está listo para editar y simular con cualquiera de las herramientas de Escher o Escher-FBA (Fig. 2d). Con un modelo más grande como iMM904, no todas las reacciones serán visibles a la vez, pero puede añadir una reacción a la visualización. En primer lugar, haga clic en el icono de la llave inglesa en la barra lateral o seleccione Añadir modo de reacción en el menú Edición. Ahora se pueden añadir reacciones haciendo clic en cualquier lugar del mapa y seleccionando la reacción deseada en el menú desplegable. El campo de entrada de texto se puede utilizar para buscar una reacción de interés.
Aplicación de Escher-FBA al diseño de fábricas de células microbianas
Para proporcionar un ejemplo de una hipótesis de investigación que se puede probar utilizando Escher-FBA, cargamos modelos a escala del genoma de E. coli que contienen dos rutas para producir 1-propanol para la producción química. Estas rutas fueron analizadas recientemente en un estudio sobre el poder predictivo de los modelos a escala del genoma para simular cepas reales de fábricas de células microbianas . El primer modelo incluye una única ruta para la producción de 1-propanol (archivo adicional 1) que fue reportada por primera vez por Atsumi et al. . El segundo modelo incluye dos rutas sinérgicas para la producción de 1-propanol (archivo adicional 2) reportado por primera vez por Shen y Liao . Cada modelo puede cargarse por separado (con el botón de menú Modelo > Cargar modelo COBRA JSON), y se proporciona un único mapa del metabolismo central que es compatible con ambos modelos (archivo adicional 3, puede cargarse con Mapa > Cargar mapa JSON).
Teníamos curiosidad por saber si el enfoque sinérgico para la producción de 1-propanol -que se sabe que tiene un mayor rendimiento de producción- también tiene una diferencia en el uso de la vía requerida. Por lo tanto, cargamos cada modelo individualmente, maximizamos la excreción de 1-propanol (pasamos por encima de EX_1poh_e y pulsamos Maximizar), establecimos el límite inferior de la excreción al 99% del máximo, y luego minimizamos el flujo a través del primer paso comprometido de la vía de las pentosas fosfato, la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH2r). Los mapas resultantes demuestran que las vías sinérgicas para la producción de 1-propanol están equilibradas estequiométricamente con la glucólisis, por lo que no requieren la actividad de la APP (Fig. 3b). Por otro lado, la vía individual requiere un flujo de PPP significativo (Fig. 3a). Otros usos de la vía, como el flujo de TCA necesario para cada caso, también pueden explorarse en estos mapas.
Uso de la vía para dos rutas heterólogas de producción de 1-propanol en E. coli. El flujo de la vía de las pentosas fosfato (PPP) necesario para cada vía de producción heteróloga puede compararse, en primer lugar, forzando la producción de 1-propanol al 99% del valor máximo (fijando el límite inferior de la reacción de intercambio de 1-propanol) y, en segundo lugar, minimizando el flujo a través del primer paso de la PPP. (a) La vía del 1-propanol descrita por Atsumi et al. utiliza una única vía para lograr la producción de 1-propanol. Requiere un flujo significativo de la APP y tiene un rendimiento global menor. (b) La vía descrita por Shen y Liao utiliza dos vías de forma sinérgica para conseguir un mayor rendimiento. La vía está equilibrada estequiométricamente con la glucólisis, por lo que no requiere flujo de PPP
Aunque Escher-FBA ya puede utilizarse para muchas simulaciones de FBA directamente en el navegador web, varios de los ejemplos presentados por Orth et al. no pueden realizarse actualmente con Escher-FBA . Por el momento, Escher-FBA no puede realizar funciones como el análisis de knockout de genes o el análisis de robustez. Sin embargo, Escher-FBA utiliza representaciones SVG flexibles para los elementos visuales, por lo que podría añadirse el análisis de robustez e incluso características gráficas como los planos de fase. Hemos establecido una hoja de ruta de desarrollo para Escher-FBA (disponible en la página web https://sbrg.github.io/escher-fba) y un proceso de desarrollo iterativo para permitir finalmente el análisis de biología de sistemas complejos en el navegador web.