Espectrometría de masas en tándem

La fragmentación de los iones en fase gaseosa es esencial para la espectrometría de masas en tándem y se produce entre las diferentes etapas del análisis de masas. Hay muchos métodos utilizados para fragmentar los iones y éstos pueden dar lugar a diferentes tipos de fragmentación y, por tanto, a diferente información sobre la estructura y la composición de la molécula.

Fragmentación en la fuenteEditar

A menudo, el proceso de ionización es lo suficientemente violento como para dejar los iones resultantes con suficiente energía interna para fragmentarse dentro del espectrómetro de masas. Si los iones producto persisten en su estado de no equilibrio durante un tiempo moderado antes de la autodisociación, este proceso se denomina fragmentación metaestable. La fragmentación en la boquilla se refiere a la inducción intencionada de la fragmentación en la fuente mediante el aumento del potencial de la boquilla en los instrumentos basados normalmente en electrospray. Aunque la fragmentación en la fuente permite el análisis de la fragmentación, no es técnicamente espectrometría de masas en tándem a menos que los iones metaestables se analicen o seleccionen en masa antes de la autodisociación y se realice una segunda etapa de análisis en los fragmentos resultantes. La fragmentación en la fuente puede utilizarse en lugar de la espectrometría de masas en tándem mediante la utilización de la tecnología Enhanced in-Source Fragmentation Annotation (EISA), que genera una fragmentación que coincide directamente con los datos de la espectrometría de masas en tándem. Los fragmentos observados por EISA tienen una mayor intensidad de señal que los fragmentos tradicionales que sufren pérdidas en las celdas de colisión de los espectrómetros de masas en tándem. EISA permite la adquisición de datos de fragmentación en analizadores de masas MS1 como los instrumentos de tiempo de vuelo y de cuadrupolo único. La fragmentación en la fuente se utiliza a menudo además de la espectrometría de masas en tándem (con fragmentación posterior a la fuente) para permitir dos pasos de fragmentación en un experimento de tipo pseudo MS3.

Disociación inducida por colisiónEditar

La fragmentación posterior a la fuente es lo que se utiliza más a menudo en un experimento de espectrometría de masas en tándem. También se puede añadir energía a los iones, que normalmente ya están excitados vibracionalmente, mediante colisiones posteriores a la fuente con átomos o moléculas neutras, la absorción de radiación o la transferencia o captura de un electrón por un ion con carga múltiple. La disociación inducida por colisión (CID), también llamada disociación activada por colisión (CAD), implica la colisión de un ion con un átomo o molécula neutra en la fase gaseosa y la posterior disociación del ion. Por ejemplo, consideremos

AB + + M ⟶ A + B + + M {\displaystyle {\ce {{AB+}+ M -> {A}+ {B+}+ M}}

donde el ion AB+ colisiona con la especie neutra M y posteriormente se rompe. Los detalles de este proceso se describen mediante la teoría de colisiones. Debido a la diferente configuración instrumental, son posibles dos tipos principales de CID (i) de tipo haz (en la que los iones precursores se fragmentan en el vuelo) y (ii) de tipo trampa de iones (en la que los iones precursores se atrapan primero y luego se fragmentan).

Un tercer y más reciente tipo de fragmentación CID es la disociación colisional de mayor energía (HCD). La HCD es una técnica de CID específica de los espectrómetros de masas orbitrap en la que la fragmentación tiene lugar de forma externa a la trampa de iones, ocurre en la celda HCD (en algunos instrumentos denominada «multipolo de enrutamiento de iones»). La HCD es una fragmentación de tipo trampa que ha demostrado tener características de tipo haz. Existen bases de datos de espectrometría de masas en tándem de alta resolución de libre acceso (por ejemplo, METLIN con 850.000 estándares moleculares cada uno con datos experimentales de CID MS/MS), y se suelen utilizar para facilitar la identificación de moléculas pequeñas.

Métodos de captura y transferencia de electronesEditar

La energía liberada cuando un electrón es transferido o capturado por un ion con carga múltiple puede inducir la fragmentación.

Disociación por captura de electronesEditar

Si se añade un electrón a un ion positivo con carga múltiple, se libera la energía de Coulomb. La adición de un electrón libre se llama disociación por captura de electrones (ECD), y se representa por

n + + e – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ ⟶ fragmentos {\displaystyle ^{n+}+{\ce {e^{-}->}\left^{(n-1)+}\right]^*}{{ce {->fragmentos}}

para una molécula M multiprotonada.

Disociación por transferencia de electronesEditar

Añadir un electrón a través de una reacción ion-ion se denomina disociación por transferencia de electrones (ETD). Similar a la disociación por captura de electrones, la ETD induce la fragmentación de cationes (por ejemplo, péptidos o proteínas) mediante la transferencia de electrones a los mismos. Fue inventada por Donald F. Hunt, Joshua Coon, John E. P. Syka y Jarrod Marto en la Universidad de Virginia.

La ETD no utiliza electrones libres sino que emplea aniones radicales (por ejemplo, antraceno o azobenceno) para este fin:

n + + A – ⟶ ( n – 1 ) + ] ∗ + A ⟶ fragmentos {\displaystyle ^{n+}+{ce {A^{-}->}\left^{(n-1)+}\right]^{*}+{ce {A->fragmentos}}.

donde A es el anión.

ETD escinde aleatoriamente a lo largo de la columna vertebral del péptido (iones c y z) mientras que las cadenas laterales y las modificaciones como la fosforilación quedan intactas. La técnica sólo funciona bien para los iones de estado de carga más alto (z>2), sin embargo, en relación con la disociación inducida por colisión (CID), la ETD es ventajosa para la fragmentación de péptidos más largos o incluso de proteínas enteras. Esto hace que la técnica sea importante para la proteómica descendente. Al igual que la ECD, la ETD es eficaz para péptidos con modificaciones como la fosforilación.

La disociación por transferencia de electrones y colisiones de alta energía (EThcD) es una combinación de ETD y HCD en la que el precursor del péptido se somete inicialmente a una reacción iónica con aniones de fluoranteno en una trampa de iones lineal, que genera iones c- y z-. En el segundo paso se aplica la fragmentación de todos los iones HCD a todos los iones derivados de la ETD para generar iones b- e y- antes del análisis final en el analizador orbitrap. Este método emplea la fragmentación dual para generar espectros MS/MS ricos en iones y, por tanto, en datos para la secuenciación de péptidos y la localización de PTM.

Disociación por transferencia negativa de electronesEditar

La fragmentación también puede producirse con una especie desprotonada, en la que un electrón se transfiere de la especie a un reactivo catiónico en una disociación por transferencia negativa de electrones (NETD):

n – + A + ⟶ ( n + 1 ) – ] ∗ + A ⟶ fragmentos {\displaystyle ^{n-}+{ce {A+->}\left^{(n+1)-}\right]^{*}+{ce {A->fragmentos}}

{{n-}+{span class=»spip»>Izquierda^{n+1)-{span class=»spip»>Derecha]^{*}+{{span class=»spip»>Fragmentos}}»>

Después de este evento de transferencia, el anión deficiente en electrones sufre un reordenamiento interno y se fragmenta. NETD es el análogo ion/ion de la disociación por desprendimiento de electrones (EDD).

NETD es compatible con la fragmentación de péptidos y proteínas a lo largo de la columna vertebral en el enlace Cα-C. Los fragmentos resultantes suelen ser iones producto de tipo a– y x.

Disociación por desprendimiento de electronesEditar

La disociación por desprendimiento de electrones (EDD) es un método para fragmentar especies aniónicas en espectrometría de masas. Sirve como modo de contrapartida negativa a la disociación por captura de electrones. Los iones con carga negativa se activan mediante la irradiación con electrones de energía cinética moderada. El resultado es la expulsión de electrones de la molécula iónica madre, lo que provoca la disociación por recombinación.

Disociación por transferencia de cargaEditar

La reacción entre péptidos cargados positivamente y reactivos catiónicos, también conocida como disociación por transferencia de carga (CTD), se ha demostrado recientemente como una vía alternativa de fragmentación de alta energía para péptidos en estado de baja carga (1+ o 2+). El mecanismo propuesto de CTD utilizando cationes de helio como reactivo es:

1 + + He + ⟶ 2 + ] ∗ + He 0 ⟶ fragmentos {\displaystyle {\ce {{{1}+}+He+->}\left^{2}+}\right]^{*}+{\ce {He^{0}->fragmentos}}.

Los primeros informes indican que el CTD provoca la escisión del enlace Cα-C de los péptidos y proporciona iones producto de tipo a– y x.

FotodisociaciónEditar

La energía necesaria para la disociación puede ser añadida por la absorción de fotones, dando lugar a la fotodisociación de iones y representada por

AB + + h ν ⟶ A + B + {\displaystyle {\ce {{AB+}+{mathit {h\nu }}->{A}+B+}}.

donde h ν {\displaystyle h\nu }

representa el fotón absorbido por el ion. Se pueden utilizar láseres ultravioletas, pero pueden provocar una fragmentación excesiva de las biomoléculas.

Disociación multifotónica infrarrojaEditar

Los fotones infrarrojos calentarán los iones y provocarán su disociación si se absorben suficientes. Este proceso se denomina disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) y suele llevarse a cabo con un láser de dióxido de carbono y un espectrómetro de masas de captura de iones como un FTMS.

Disociación radiativa infrarroja de cuerpo negroEditar

La radiación de cuerpo negro puede utilizarse para la fotodisociación en una técnica conocida como disociación radiativa infrarroja de cuerpo negro (BIRD). En el método BIRD, toda la cámara de vacío del espectrómetro de masas se calienta para crear luz infrarroja. La BIRD utiliza esta radiación para excitar vibraciones cada vez más energéticas de los iones, hasta que se rompe un enlace, creando fragmentos. Esto es similar a la disociación multifotónica infrarroja, que también utiliza luz infrarroja, pero de una fuente diferente. La BIRD se utiliza más a menudo con la espectrometría de masas de resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier.

Disociación inducida en la superficieEditar

Con la disociación inducida en la superficie (SID), la fragmentación es el resultado de la colisión de un ion con una superficie bajo alto vacío. En la actualidad, la SID se utiliza para fragmentar una amplia gama de iones. Hace años, sólo era habitual utilizar la SID en especies de baja masa y con carga única porque los métodos de ionización y las tecnologías de los analizadores de masas no estaban lo suficientemente avanzados como para formar, transmitir o caracterizar adecuadamente los iones de alto m/z. Con el tiempo, las superficies monocapa autoensambladas (SAM) compuestas de CF3(CF2)10CH2CH2S sobre oro han sido las superficies de colisión más utilizadas para la SID en un espectrómetro en tándem. Las SAMs han actuado como los objetivos de colisión más deseables debido a sus características de grandes masas efectivas para la colisión de los iones entrantes. Además, estas superficies están compuestas por cadenas rígidas de fluorocarbono, que no amortiguan de forma significativa la energía de los iones proyectiles. Las cadenas de fluorocarbono también son beneficiosas por su capacidad de resistir la transferencia fácil de electrones de la superficie metálica a los iones entrantes. La capacidad de la SID para producir subcomplejos que permanecen estables y proporcionan información valiosa sobre la conectividad no tiene parangón con ninguna otra técnica de disociación. Dado que los complejos producidos a partir de la SID son estables y conservan la distribución de la carga en el fragmento, esto produce un espectro único, en el que el complejo se centra en torno a una distribución m/z más estrecha. Los productos de SID y la energía a la que se forman reflejan la fuerza y la topología del complejo. Los patrones de disociación únicos ayudan a descubrir la estructura cuaternaria del complejo. La distribución simétrica de la carga y la dependencia de la disociación son exclusivas de la SID y hacen que los espectros producidos sean distintos a los de cualquier otra técnica de disociación.

La técnica de la SID también es aplicable a la espectrometría de masas de movilidad iónica (IM-MS). Tres métodos diferentes para esta técnica incluyen el análisis de la caracterización de la topología, la conectividad intersubunitaria y el grado de desdoblamiento de la estructura de la proteína. El análisis del desdoblamiento de la estructura proteica es la aplicación más utilizada de la técnica SID. En el caso de la espectrometría de masas de movilidad iónica (IM-MS), el SID se utiliza para la disociación de los precursores activados en origen de tres tipos diferentes de complejos proteicos: Proteína C-reactiva (CRP), transtiretina (TTR) y concanavalina A (Con A). Este método se utiliza para observar el grado de despliegue de cada uno de estos complejos. Para esta observación, la SID mostró las estructuras de los iones precursores que existen antes de la colisión con la superficie. La IM-MS utiliza la SID como una medida directa de la conformación de cada subunidad de las proteínas.

La resonancia de ciclotrón iónico por transformación de Fourier (FTICR) es capaz de proporcionar una resolución ultra alta y una gran precisión de masa a los instrumentos que realizan mediciones de masa. Estas características hacen que los espectrómetros de masas FTICR sean una herramienta útil para una amplia variedad de aplicaciones, como varios experimentos de disociación, como la disociación inducida por colisión (CID), la disociación por transferencia de electrones (ETD) y otros. Además, la disociación inducida por superficie se ha implementado con este instrumento para el estudio de la fragmentación fundamental de péptidos. En concreto, la SID se ha aplicado al estudio de la energía y la cinética de la fragmentación en fase gaseosa dentro de un instrumento ICR. Este enfoque se ha utilizado para comprender la fragmentación en fase gaseosa de los péptidos protonados, los iones péptidos de electrones impares, los complejos ligando-péptido no covalentes y los cúmulos metálicos ligados.