Etiquetado con 18O: una herramienta para la proteómica

Se presenta una evaluación del etiquetado proteolítico y la cuantificación de proteínas con fines de diagnóstico utilizando tripsina y H2O enriquecido con 18O. Demostramos que la cuantificación comparativa o relativa se puede realizar eficazmente con este enfoque. Hemos desarrollado un protocolo que permite la conservación de los péptidos etiquetados en agua de abundancia natural sin temor a que se produzca un retroceso, siempre que el pH sea lo suficientemente bajo como para apagar la actividad catalítica de la tripsina, pero no tan bajo como para promover el retroceso químico. Dado que la eficacia del etiquetado depende de la naturaleza del péptido, no existe una relación lineal simple entre el contenido relativo de la mezcla de tampón de digestión 16O/18O (x) y la eficacia del etiquetado (y), sino que sigue una relación basada en la probabilidad y = x(2). Por lo tanto, el grado de etiquetado de péptidos utilizando las proporciones de la mezcla de tampón de digestión 16O/18O puede desviarse significativamente de lo esperado en base a una relación lineal. La evaluación de la eficiencia relativa de Ziptip indicó una pérdida en la recuperación de la muestra a medida que la concentración del péptido se redujo utilizando condiciones normales, lo que sugiere que hay un límite por debajo del cual hay rendimientos decrecientes. Además, las pérdidas de adsorción debidas al secado y la recuperación de Speedvac indicaron pérdidas modestas (20%) que pueden variar ampliamente (0-50%) de un péptido a otro. La eficacia de la digestión en solución de las mezclas de proteínas estándar en función de la concentración reveló una disminución lineal con la disminución de la concentración. Esto es coherente con los efectos cinéticos de la enzima y pone de relieve un posible error de cuantificación que podría surgir al evaluar la expresión diferencial basada en la detección de péptidos. Los resultados de nuestros estudios demuestran el poder del etiquetado con 18O como herramienta de optimización para el desarrollo de procesos proteómicos.