Evidencia para la teoría de los radicales libres/estrés oxidativo del envejecimiento del consorcio CHANCES: a meta-analysis of individual participant data

Study population

Esta investigación se basa en las cohortes HAPIEE (Health, Alcohol and Psychosocial factors in Eastern Europe) de Polonia, República Checa y Lituania , y en el seguimiento de 8 años de la cohorte alemana ESTHER (nombre alemán: «Epidemiologische Studie zu Chancen der Verhütung, Früherkennung und optimierten Therapie chronischer Erkrankungen in der älteren Bevölkerung») .

El estudio HAPIEE comprende cohortes de cuatro países. Como no fue posible exportar muestras de sangre de Rusia, sólo se incluyeron tres cohortes en el presente análisis. Los participantes en el estudio fueron reclutados en seis ciudades checas (Havirov/Karvina, Hradec Kralove, Jihlava, Kromeriz, Liberec y Usti nad Labem) en 2002-2005 (n = 8.857), en Cracovia, Polonia, en 2002-2005 (n = 10.728), y en Kaunas, Lituania, en 2006-2008 (n = 7.161). Cada cohorte se compone de una muestra aleatoria de hombres y mujeres de entre 45 y 75 años de edad al inicio del estudio, estratificada por sexo y grupos de edad de 5 años, seleccionada a partir de registros de población. La tasa de respuesta global fue del 61%. Los datos se recogieron mediante un cuestionario y un breve examen en una clínica durante el cual se tomó una muestra de sangre venosa en ayunas.

El estudio ESTHER es una cohorte de base poblacional de 9.949 adultos, de entre 50 y 74 años de edad en la línea de base, reclutados por sus médicos de cabecera (GP) durante un chequeo de salud de rutina entre 2000 y 2002 en el estado federal alemán de Saarland . La presente investigación se basa en el seguimiento de 8 años, realizado entre julio de 2008 y diciembre de 2010, en el que los participantes del estudio tenían entre 56 y 85 años. Desde el inicio del estudio hasta los 8 años de seguimiento, 499 personas fallecieron, 505 no pudieron participar debido a su mal estado de salud y 680 rechazaron seguir participando. De los 8.265 participantes restantes, 6.061 devolvieron un cuestionario (tasa de respuesta, 73,4%) y 4.637 donaron una muestra de sangre en la consulta de su médico de cabecera. Los médicos de cabecera de los participantes en el estudio también rellenaron un cuestionario sobre el estado de salud de los participantes en el estudio (disponible para n = 5.997). Además, 3.124 participantes en el estudio dieron su consentimiento para una evaluación geriátrica adicional de 3 horas realizada por los médicos del estudio en los domicilios de los participantes.

Las variables de los estudios ESTHER y HAPIEE se armonizaron y los marcadores de estrés oxidativo se midieron en el marco del Consorcio sobre Salud y Envejecimiento: Network of Cohorts in Europe and the United States (CHANCES; www.chancesfp7.eu), que se ha descrito en otro lugar . Los estudios se realizan de acuerdo con la declaración de Helsinki y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en el estudio.

Etica, consentimiento y permisos

Los estudios incluidos fueron aprobados por los respectivos comités éticos locales (ESTHER: Facultad de Medicina de la Universidad de Heidelberg y la Asociación Médica del Sarre; HAPIEE: University College London (Gran Bretaña), Instituto Nacional de Salud Pública (Praga, República Checa), Universidad Jagellónica (Cracovia, Polonia) y Universidad Lituana de Ciencias de la Salud (Kaunas, Lituania)). Se ha obtenido el consentimiento informado por escrito de todos los participantes incluidos en los estudios analizados y los estudios se están llevando a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Evaluación de las covariables

En los estudios ESTHER y HAPIEE, los datos sociodemográficos, de estilo de vida y de antecedentes de enfermedad se evaluaron mediante cuestionarios autoadministrados. La altura y el peso se midieron y se complementaron con información autodeclarada en ESTHER para aquellos participantes del estudio que no dieron su consentimiento a la visita domiciliaria. Además de la información autodeclarada, el historial de enfermedades crónicas comunes se validó en el estudio ESTHER mediante la consulta de las historias clínicas o del registro de cáncer del Sarre. La insuficiencia renal se definió por una tasa de filtración glomerular estimada <60 mL/min/1,73 m2, calculada con la ecuación de la Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration basada en la creatinina. En la cohorte ESTHER, las concentraciones de creatinina sérica se evaluaron con un método cinético Jaffé en un Cobas 8000 C701 (analito: CREJ2 3000, Roche). El colesterol total y el colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) se evaluaron en muestras de suero mediante cromatografía enzimática (analitos: Chol2 2100, HDLC3 450, Roche) y la proteína C reactiva (PCR) mediante inmunoturbidimetría en el Cobas 8000 C701 (analito: CRPL3 500, Roche). En el HAPIEE, el colesterol total y el colesterol HDL también se evaluaron con la misma metodología de ensayo y los mismos analitos de Roche, pero se utilizaron diferentes autoanalizadores (HAPIEE República Checa y Lituania: Roche Cobas Mira; HAPIEE Polonia: Hitachi 917/Modular P). Además, en todas las cohortes de HAPIEE, la creatinina y la PCR séricas se evaluaron con la misma metodología de ensayo que en ESTHER, pero con analitos de un proveedor diferente (Beckman-Coulter) y en un autoanalizador diferente (LX-20 Pro, Beckman-Coulter).

Consecución de la mortalidad

Para estos análisis, se utilizó el seguimiento de la mortalidad total por parte de los registros oficiales de mortalidad de todo el país (República Checa, Alemania), locales (Lituania) o regionales (Polonia) hasta el 31 de diciembre de 2010, en Polonia, el 31 de diciembre de 2011, en la República Checa y Lituania, y hasta el 31 de julio de 2014, en Alemania. La mortalidad por causa específica en Alemania sólo estaba disponible para las muertes ocurridas hasta el 2 de abril de 2013. Los registros estaban completos para todos los participantes que no se trasladaron fuera de la región cubierta por el registro. La pérdida de seguimiento debida a la migración fue del 4 % en las cohortes HAPIEE (combinadas) y del 2 % en el estudio ESTHER. Todas las muertes codificadas con los códigos ICD-10 I00-I99 se consideraron muertes cardiovasculares y las muertes por cáncer se definieron con los códigos ICD-10 C00-C97.

Medición de marcadores séricos de estrés oxidativo

Los ensayos utilizados para medir los niveles de d-ROMs (Diacron, Grosseto, Italia) y TTL (Rel Assay Diagnostics, Gaziantep, Turquía) se adaptaron a un autoanalizador (LX20-Pro, Beckman-Coulter, Woerden, Países Bajos) en el Laboratory for Health Protection Research (Bilthoven, Países Bajos), tal y como se ha descrito previamente . El ensayo d-ROMs mide la concentración de hidroperóxido en Unidades Carratelli (U Carr), llamadas así por el inventor del ensayo, Mauro Carratelli. Cada U Carr corresponde a 0,08 mg de peróxido de hidrógeno (H2O2)/100 mL en la muestra. El ensayo TTL mide la concentración de grupos tiol libres en la muestra en μmol/L.

Las mediciones se realizaron en muestras de suero que habían sido almacenadas durante aproximadamente 3-10 años en congeladores a -80 °C. Los d-ROM y TTL tienen una buena estabilidad a largo plazo en estas condiciones . En el seguimiento de 8 años de ESTHER, se midieron los d-ROMs y TTL en todos los participantes que donaron muestras de sangre en las consultas de sus médicos de cabecera (n = 4.637). Sin embargo, las mediciones se realizaron en dos momentos diferentes porque no se disponía de fondos para medir todas las muestras en el estudio piloto realizado en junio de 2012 . Para corregir los posibles cambios en los ensayos, se volvieron a medir 80 muestras del punto temporal 1 (junio de 2012) en el punto temporal 2 (septiembre de 2014) y se obtuvieron ecuaciones de regresión lineal que se utilizaron para estandarizar los resultados del punto temporal 2 a los niveles del punto temporal 1, cuando también se realizaron las mediciones en las cohortes de HAPIEE (a lo largo del año 2012). La concordancia de las mediciones de d-ROMs fue alta (coeficiente de correlación de Spearman r = 0,92 y diferencia de medias = 15 Carr U) y por tanto no se aplicaron correcciones. En el caso del TTL, se corrigió un desplazamiento evidente de los resultados del ensayo (r = 0,88 y diferencia de medias = 81 μmol/L) aplicando la siguiente ecuación a todas las mediciones del punto temporal 2: TTLpunto temporal2 = 0,746 × TTLpunto temporal1. Además, se excluyeron 610 mediciones en muestras de sangre que no cumplían los criterios estrictos de calidad hemolítica, ictérica y lipémica en el estudio ESTHER, quedando 4.027 para el análisis en el presente estudio. En las cohortes de HAPIEE, el número de muestras que no cumplían estos criterios de calidad era insignificante.

Muestra del estudio analítico

Debido a la limitación de fondos, no se midieron los niveles de d-ROMs y TTL en todos los participantes de las cohortes de HAPIEE; en su lugar, se adoptó un diseño de control de casos emparejados (archivo adicional 1: Figura S1). Los casos se definieron como todos los sujetos que murieron durante el seguimiento (n = 1.433) o que experimentaron un infarto de miocardio (IM) o un ictus no mortal (n = 658). Los controles (n = 4.396) se emparejaron con los casos por sexo y grupos de edad de 5 años. Para corregir el sobremuestreo de IM e ictus en este análisis de mortalidad, se excluyeron de los casos en un primer paso los sujetos con IM no mortal o ictus no mortal durante el seguimiento. Para añadir a los controles una muestra representativa de sujetos con IM o ictus incidentes no mortales, en un segundo paso se calculó la proporción observada de IM o ictus incidentes no mortales en cada estrato específico de edad y sexo en la cohorte total. En un tercer paso, estas proporciones se multiplicaron por los tamaños de las muestras en cada estrato en los controles con marcadores de estrés oxidativo medidos. En un cuarto paso, los números resultantes se seleccionaron aleatoriamente en cada estrato del grupo de sujetos con IM o ictus incidentes no mortales y se añadieron a los controles, lo que dio lugar a un conjunto de 4.552 controles elegibles para las 1.433 muertes. En el último paso, el grupo de controles elegibles se utilizó para emparejar individualmente exactamente dos controles con cada muerte por cohorte, sexo y edad (±5 años).

Análisis estadísticos

Las diferencias en las características basales entre los casos (muerte durante el seguimiento) y los controles se evaluaron con la prueba de la χ2 para las variables categóricas y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para las variables continuas. Las asociaciones transversales de los factores de riesgo de mortalidad establecidos con los niveles elevados de estrés oxidativo se evaluaron con modelos de regresión logística que comprendían todas las características basales modeladas como variables categóricas (Tabla 1). La variable dependiente «estrés oxidativo elevado» se definió mediante dos definiciones diferentes basadas en los niveles de d-ROMs o TTL. Para los d-ROMs, según las instrucciones del fabricante, se empleó un punto de corte clínico de >400 Carr U, que clasificó al 23 % de la cohorte ESTHER y al 30 % de los controles elegibles de la cohorte HAPIEE en la categoría de estrés oxidativo «alto». Para el TTL, no se dispone de puntos de corte clínicos y, dado que el ensayo aún no está estandarizado, las medias de la población variaron mucho entre las cohortes. Por lo tanto, para igualar la proporción de individuos con estrés oxidativo alto obtenida por la definición basada en los niveles de d-ROMs, se utilizó el cuartil inferior de TTL específico de la cohorte (25 %) para clasificar a los sujetos en una categoría de estrés oxidativo alto basada en TTL. Los análisis transversales se realizaron en todos los sujetos y por separado para mujeres y hombres.

Tabla 1 Características basales de los participantes en el estudio por cohorte y estado de los casos (muerte durante el seguimiento) y número de casos para los análisis de mortalidad por causa específica por cohorte

Para los análisis longitudinales, Se utilizó la regresión de riesgos proporcionales de Cox (cohorte ESTHER) y la regresión logística condicional (estudio de casos y controles emparejados HAPIEE) para estimar los cocientes de riesgos y los cocientes de probabilidades, respectivamente, para un aumento de los niveles de d-ROMs y una disminución del TTL en una desviación estándar (DE) específica de la cohorte. Además, los niveles de d-ROMs también se modelaron como una variable categórica, con los puntos de corte clínicos recomendados por el fabricante para el estrés oxidativo moderado (341-400 Carr U), alto (401-500 Carr U) y muy alto (>500 Carr U) con referencia a los sujetos con estrés oxidativo no aumentado o bajo (≤340 Carr U). Cuando el riesgo absoluto es bajo, la regresión logística y la de Cox suelen producir resultados similares y la odds ratio puede considerarse una aproximación de la hazard ratio, más precisa. Utilizamos el término riesgo relativo (RR) para ambas estimaciones del efecto. En el análisis de sensibilidad, los análisis sobre la mortalidad por causa específica en la cohorte ESTHER se llevaron a cabo teniendo en cuenta el riesgo competitivo de muerte por otras causas mediante el ajuste de un modelo de regresión de riesgos de subdistribución proporcional con ponderaciones para los sujetos que sufrieron el evento de riesgo competitivo según una extensión del método de Fine y Gray . Sin embargo, los resultados fueron casi idénticos a los de la regresión de riesgos proporcionales de Cox tradicional y, por lo tanto, en este manuscrito sólo se muestran los últimos resultados.

Los análisis se realizaron por separado para cada cohorte y se agruparon mediante metaanálisis con ponderación de Mantel-Haenszel y efectos aleatorios , teniendo en cuenta el tamaño de la muestra de las cohortes y la posibilidad de heterogeneidad estadística entre los estudios. Esta última se examinó con la prueba Q de Cochrane y la estadística I2.

Se analizaron los siguientes resultados: mortalidad por todas las causas, por ECV, por cáncer y por causas no relacionadas con el cáncer. Para cada resultado, se desarrollaron cuatro modelos estadísticos, con una inclusión creciente de factores de riesgo de mortalidad establecidos en los modelos. Tanto los niveles de d-ROMs como el TTL se incluyeron siempre en el mismo modelo porque su correlación era baja (r <0,08 en cada cohorte). En el modelo 1, se realizó un ajuste por edad y sexo en la cohorte ESTHER, mientras que esto no fue necesario para las cohortes HAPIEE porque los casos se emparejaron individualmente con dos controles por edad y sexo y se analizaron en un análisis estratificado en el que los estratos consisten en la colección de conjuntos emparejados. El modelo 2 ajustó además por educación, índice de masa corporal (IMC), tabaquismo, consumo de alcohol y actividad física. El modelo 3 también incluyó las enfermedades que podrían mediar en la asociación del estrés oxidativo con la mortalidad (es decir, la dislipidemia (evaluada por el colesterol total y el colesterol HDL), la insuficiencia renal, los antecedentes de diabetes, la hipertensión, el IM, el accidente cerebrovascular y el cáncer). Por último, el modelo 4 se ajustó adicionalmente por los niveles de PCR, que estaban fuertemente correlacionados con los niveles de d-ROMs (r = 0,34-0,41 en las cohortes) y, con menor intensidad, con el TTL (r = 0,11-0,17 en las cohortes). La edad se modeló como una variable continua y todas las demás variables se modelaron como variables categóricas (las categorías se muestran en la Tabla 1). Se comprobaron las interacciones entre d-ROMs/TTL con las covariables añadiendo los términos de interacción apropiados al modelo 2.

Los subgrupos a analizar se eligieron a priori con el objetivo de estratificar para los determinantes potenciales más importantes de los niveles elevados de estrés oxidativo: cohorte/país, edad, sexo, antecedentes de IM o cáncer y estado inflamatorio. Debido a las limitaciones del tamaño de la muestra, los análisis estratificados se restringieron a la mortalidad por todas las causas, la ECV y el cáncer. Para abordar la posibilidad de un sesgo de causalidad inversa, los análisis se realizaron por separado para los eventos ocurridos en los años 1-2, 3-4 y 5-6 de seguimiento. Debido a las limitaciones del tamaño de la muestra, este análisis estratificado sólo pudo realizarse para la mortalidad por todas las causas. Para evitar la inestabilidad del modelo, el resultado del análisis de un subgrupo específico de la cohorte sólo se consideró para el metanálisis cuando se produjeron al menos 25 eventos en el subgrupo.

Se empleó la imputación múltiple para imputar el número de valores de covariables basales faltantes que se muestran en el archivo adicional 1: Tabla S1. La proporción de valores perdidos fue inferior al 5 % para todas las variables, con la excepción del consumo de alcohol y la actividad física, que tenían hasta un 22 % de valores perdidos. Hasta donde sabemos, los datos faltaban de forma aleatoria, que es el supuesto de la imputación múltiple. Por separado, por cohorte, estado de los casos y sexo, se imputaron 20 conjuntos de datos completos con el procedimiento «PROC MI» de SAS 9.3, utilizando el método de Monte Carlo con cadena de Markov. Se utilizaron las variables del modelo «completo» para el modelo de imputación. Todos los análisis multivariables se realizaron en los 20 conjuntos de datos imputados y los resultados de los conjuntos de datos individuales se combinaron mediante el procedimiento «PROC MIANALYZE» de SAS 9.3.

Los metanálisis se realizaron con el software estadístico Comprehensive Meta-Analysis 2.0 (Biostat, Englewood, NJ, USA). Todos los demás análisis se realizaron con SAS, versión 9.2 (Cary, Carolina del Norte, EE.UU.). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, utilizando un nivel alfa de 0,05.

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