Fronteras en Medicina

Introducción

La colonoscopia es el método preferido para evaluar la salud intestinal de la mayoría de los pacientes y es el estándar de oro para el diagnóstico del cáncer colorrectal, que puede descubrir claramente las lesiones intestinales (1). Antes de la colonoscopia, se suele utilizar la preparación del intestino para garantizar que no queden residuos en la pared intestinal que afecten al proceso de examen y a los resultados mediante la utilización de una dieta ajustada y medicamentos relacionados, y la adecuación de la preparación del intestino puede afectar directamente al efecto final de la colonoscopia (2). En la actualidad, el polietilenglicol (PEG) se utiliza ampliamente para la limpieza intestinal antes de la colonoscopia debido a su eficacia y amplia aceptabilidad (3).

Como sabemos, la microbiota intestinal es importante para mantener la salud humana. En condiciones fisiológicas, en el tracto intestinal coexisten en una proporción estable bacterias anaerobias fisiológicas simbióticas, bacterias patógenas condicionales simbióticas y otras bacterias dañinas. Sin embargo, cuando la microbiota intestinal se altera o la proporción de la microbiota intestinal se desequilibra, se producen los correspondientes cambios fisiopatológicos (4). Durante el procedimiento de preparación del intestino, una gran cantidad de líquido entra en el tracto intestinal y altera considerablemente el entorno de la cavidad intestinal normal, y la toma de laxantes puede potenciar la discinesia intestinal y el peristaltismo intestinal, lo que hace que las bacterias no puedan adherirse a la mucosa intestinal (5). Además, la gran cantidad de oxígeno aportada por la preparación del intestino en el entorno intestinal reduce en gran medida el número de bacterias anaerobias, y promueve el crecimiento de las bacterias aerobias, lo que da lugar a un trastorno microbiano intestinal (6).

Los probióticos son «microorganismos vivos que pueden tener efectos beneficiosos para el huésped cuando se ingieren dosis suficientes» (7), estudios anteriores indican que los probióticos desempeñan un papel activo en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo el síndrome del intestino irritable, la enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer de colon (8, 9). Nuestros estudios anteriores indicaron que los preparados probióticos tienen efectos importantes en la reducción de la respuesta inflamatoria después de la gastrostomía y en la mejora de los síntomas gastrointestinales en pacientes postoperatorios (10), y los preparados probióticos también aliviaron significativamente la inflamación de la mucosa oral causada por la radioterapia en pacientes con carcinoma nasofaríngeo (11). Aunque se ha prestado atención a los efectos secundarios de los preparados intestinales, por ejemplo desequilibrio de la microbiota intestinal y daños en la mucosa intestinal en los círculos académicos, se han realizado pocos trabajos para reducir los efectos secundarios de la preparación intestinal mediante el uso de suplementos probióticos.

En el presente estudio, se utilizó el fármaco probiótico clínico de Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets para evaluar su efecto en los voluntarios que recibían la preparación intestinal, y se aplicó la secuenciación de alto rendimiento para evaluar si los probióticos tenían efectos positivos en el trastorno de la microbiota intestinal causado por la preparación intestinal.

Materiales y métodos

Declaración ética

El presente estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Nanchang (Nanchang, China). Los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras. El proyecto también ha sido registrado y aprobado por el Centro de Registro de Ensayos Clínicos de China (ChiCTR1900022539).

Diseño del estudio e inscripción de pacientes

El ensayo se llevó a cabo en el Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Nanchang en China entre diciembre de 2018 y noviembre de 2019. Se inscribieron 32 sujetos (29 hombres, 3 mujeres), con una edad media de 51 años (rango de 30 a 70 años), altura de 1,66 m, peso de 61,78 kg, índice de masa corporal (IMC) de 22,39. Cinco participantes tenían antecedentes de hipertensión, cuatro tenían antecedentes de diabetes y tres tenían antecedentes de hipertensión y diabetes. Según las normas, no se interrumpió la medicación durante el proceso del estudio. Además, ningún participante tomó antibióticos durante el tema, ni había desarrollado una infección recientemente, y no se tomaron otros probióticos y yogures. Ninguno de estos voluntarios era vegetariano (Tabla 1).

Protocolo del ensayo

Los 32 voluntarios se dividieron en dos grupos: grupo placebo (grupo C, n = 16) y grupo probiótico (grupo P, n = 16). Probiótico (Bifidobacterium Tetragenous viable Bacteria Tablets (SiLianKang), Hangzhou Grand Biologic Pharmaceutical Inc., Hangzhou, China. Número de aprobación de la SFDA: S20060010, que contiene >0,5 × 106 UFC/tabla Bifidobacterium infantis, >0,5 × 106 UFC/tabla Lactobacillus acidophilus, >0,5 × 106 UFC/tabla Enterococcus faecalis, y >0,5 × 105 UFC/tabla Bacillus cereus). Se sugirió a los participantes que comieran gachas, fideos y otras dietas bajas en fibra el día anterior a la preparación del intestino, y comieron normalmente después de la colonoscopia. Se prohibieron los antibióticos durante el proceso de tratamiento, así como la bebida y la acritud. Todos ellos empezaron a tomar placebo o preparados probióticos después de la colonoscopia durante un máximo de 5-7 días (tres comprimidos y tres veces al día).

Los participantes tomaron 2 L de polietilenglicol (PEG, número de aprobación de la SFDA: H20020031, que contenía el paquete A: 0,74 g de cloruro de potasio y 1,68 g de bicarbonato de sodio, el paquete B: 1,46 g de cloruro de sodio y 5.68 g de sulfato de sodio, paquete C: 60 g de polietilenglicol 4.000) 4-5 horas antes de la colonoscopia y el PEG debía tomarse por completo en el plazo de 1 hora. Tras la anestesia intravenosa con 1 ml de inyección de clorhidrato de lidocaína (número de aprobación de la SFDA: H37021309), 1 ml de inyección de clorhidrato de nalbufina (número de aprobación de la SFDA: H20130127) y 20 ml de inyección de emulsión de propofol (número de aprobación de la SFDA: H20051843), los participantes se sometieron a la colonoscopia. Si los participantes no toleraban la colonoscopia, se añadían anestésicos según el caso. Se recogieron heces en 3 pintas de tiempo (3 días antes, el mismo día de la preparación intestinal justo antes de la colonoscopia, y 7 días después del proceso). Las muestras recogidas se almacenaron en glicerol al 50% (Cat#56-81-5; Sengon Biotech, China) y se guardaron inmediatamente a -80°C para su uso posterior.

Extracción de ADN genómico bacteriano total y secuenciación de alto rendimiento

Se recogieron un total de 96 muestras fecales y se utilizó el método de voladura de cuentas combinado con el kit de ADN genómico (Tiangen Biotech Co., Ltd., Pekín, China) para extraer el ADN microbiano fecal (12). La concentración y la pureza del ADN purificado se determinaron mediante un espectrofotómetro a 230 nm (A 230) y 260 nm (A 260) (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). La región V4 del gen del ADNr 16S de cada muestra se amplificó con el cebador 515F/806R (515F, 5′-GCACCTAAYTGGYDTAAAGNG-3′; 806R, 5′- TACNVGGTATCTAATCC-3′), y los productos de la PCR se secuenciaron en la plataforma IlluminaHiSeq 2000 (número de acceso al GenBank PRJNA597277) (13).

Análisis de datos

Para analizar los datos de secuenciación de alto rendimiento, se utilizaron Cutadapt (versión 1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/), el algoritmo UCHIME http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html, el paquete de software UPARSE (versión 7.0.100), el software QIIME (versión 1.9.1), el paquete de software QIIME (versión 1.8.0) y el software SIMCA-P (versión 11.5; Umetrics; Sartorius Stedim Biotech, Malmö, Suecia) se utilizaron para determinar la diversidad α (dentro de las muestras, índices de OTUs observados, Chao1, Shannon, Simpson, ACE y cobertura de bienes) y la diversidad β (entre las muestras, PCA, PCoA y NMDS) (14, 15).

Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (SD). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism (versión 7.0; GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.) y el software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La significación estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey y de pruebas F. Las probabilidades de error de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Resultados

Características basales de los pacientes

Entre diciembre de 2018 y noviembre de 2019, se inscribieron 32 voluntarios en el grupo de placebo (grupo C, 16 voluntarios) y el grupo de probióticos (grupo P, 16 voluntarios), y su sexo, edad, IMC, características basales, antecedentes médicos y reacción gastrointestinal antes y después de la preparación intestinal se resumieron en la Tabla 1. No hubo diferencias significativas entre el grupo C y el grupo P.

Efecto de la preparación intestinal en los microorganismos intestinales

Para explorar si la preparación intestinal puede afectar a los microorganismos intestinales, se amplificó la región hipervariable V4 de las bacterias mediante el método de secuenciación de amplicones de ADNr 16S de las heces de 16 voluntarios antes (grupo CB), durante (grupo CM) y después de la preparación intestinal (grupo CA).

En las Figuras 1A-C, el índice de Shannon, el índice de Simpson y las especies observadas indicaron que la ocurrencia de la preparación intestinal afectó ligeramente la α-diversidad de la comunidad microbiana intestinal entre los grupos CB y CM, CB y CA, mientras que afectó significativamente la diversidad microbiana entre los grupos CM y CA (P < 0,05). Y el análisis de coordenadas principales (PCoA) mostró que la diversidad microbiana en el grupo CM y el grupo CA eran diferentes en comparación con la del grupo CB (Figura 1D). Además, los resultados del índice de Venn (Figura 1E) indicaron que había 2.068, 3.426 y 1.695 OTU en los grupos CB, CM y CA, y su porcentaje de OTU comunes era del 27,71% (573/2.068), 16,73% (573/3.426) y 33,81% (573/1.695), respectivamente.

Además, analizamos las bacterias dominantes a nivel de filo (Figuras 2A-E), y descubrimos que Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria eran los filos predominantes en estos 3 grupos. Los resultados revelaron que la preparación del intestino aumentó la abundancia relativa de Proteobacterias (0,266 frente a 0,410) mientras que disminuyó la abundancia relativa de Actinobacterias (0,044 frente a 0,029), y tuvo un ligero efecto sobre la abundancia relativa de Firmicutes (0,462 frente a 0,408) y Bacteroidetes (0,194 frente a 0,136) en comparación con el grupo CB. Siete días después de la preparación del intestino, la abundancia relativa de Proteobacterias disminuyó de 0,410 a 0,335. Curiosamente, la abundancia relativa de Actinobacterias aumentó de 0,029 a 0,119, mientras que la abundancia relativa de Firmicutes (0,409 frente a 0,389) y Bacteroidetes (0,136 frente a 0,126) siguió mostrando una tendencia a la baja en comparación con el grupo CM. A nivel de género (Figuras 2F-J), durante la preparación del intestino, se observó que la abundancia relativa de Bacteroides y Acinetobacter eran bacterias dominantes, la abundancia relativa de Acinetobacter (0,042 vs. 0,176) se incrementó significativamente. 0,176), y la abundancia relativa de Streptococcus (0,020 frente a 0,008), Bifidobacterium (0,036 frente a 0,022) y Faecalibacterium (0,075 frente a 0,065) estaba ligeramente alterada en comparación con el grupo CB. Sin embargo, siete días después de la preparación intestinal, se produjo un aumento significativo del porcentaje de Streptococcus (0,007 frente a 0,068) y Bifidobacterium (0,022 frente a 0109), y una disminución de la abundancia relativa de Faecalibacterium (0,065 frente a 0,031) y Acinetobacter (0,176 frente a 0,136) en comparación con el grupo CM.

Efecto de la preparación probiótica en el equilibrio microbiano intestinal

Para evaluar los efectos de los probióticos en la microbiota intestinal de los voluntarios que recibieron la preparación intestinal, se recogieron heces antes (grupo PB), durante (grupo PM) y después de la preparación intestinal (grupo PA) durante 7 días (han tomado la preparación probiótica durante 5-7 días).

Observamos que la preparación intestinal había afectado notablemente la α-diversidad en el índice de Shannon (Figura 3A) y el índice de Simpson (Figura 3B, P < 0,05) de la comunidad microbiana entre los grupos PB y PM. Curiosamente, las especies observadas recibieron un aumento evidente después de la preparación del intestino, pero una reducción evidente 7 días después del tratamiento (Figura 3C). Además, los resultados del PCoA indicaron que la toma de probióticos restauró en gran medida la microbiota alterada hasta el nivel normal en el grupo PM y en el grupo PA (Figura 3D), y las OTU comunes ocuparon el 28,68% (508/1.771), el 23,67% (508/2.146) y el 36,92% (508/1.376) del total de OTU en los grupos PB, PM y PA, respectivamente.

A continuación, se evaluaron los efectos de la intervención probiótica en la composición microbiana, y se encontró que la suplementación de probióticos redujo significativamente las Proteobacterias (0.515 frente a 0,173) y aumentó considerablemente la abundancia relativa de Bacteroides (0,166 frente a 0,338) en el grupo PM en comparación con el grupo PA a nivel de filo (P < 0,05). A nivel de género, los probióticos suplementados redujeron obviamente el porcentaje de Acinetobacter (0,204 frente a 0,071) en el grupo PM en comparación con el grupo PA, y aumentaron significativamente el porcentaje de Bifidobacterium (0.017 frente a 0,110), Bacteroides (0,095 frente a 0,155) y Faecalibacterium (0,028 frente a 0,060) en el grupo PM en comparación con el grupo PA (Figuras 4F-J).

Los cambios microbianos entre los grupos CA y PA

Para comprender mejor el efecto de los probióticos en la preparación del intestino, comparamos la diversidad microbiana entre los voluntarios de los grupos CA y PA. Como se muestra en las Figuras 5A-C, la suplementación de probióticos había mejorado notablemente el índice de Shannon y el índice de Simpson (P < 0,05), mientras que disminuyó las especies observadas. Los resultados del PCoA indicaron que las muestras del grupo CA y del grupo PA se dispersaron mucho entre sí (Figura 5D). Había 1.695 y 1.376 OTU en el grupo CA y en el grupo PA, y el número común de OTU era de 570 (Figura 5E). Además, el análisis de Lefse demostró que Bacteroidia (en la clase), Bacteroidetes (en el phylum), Bacteroidaceae (en la familia), Bacteroides (en el género), Fusobacteriaceae (en la familia), Porphyromonadaceae (en la familia) y Parabacteroides (en el género) eran significativamente mayores en el grupo PA que en el grupo CA (Figura 5F).

A continuación, se compararon las bacterias específicas del grupo CA y del grupo PA. La suplementación de probióticos enriqueció notablemente el porcentaje de Bacteroidetes (0,126 frente a 0,338), mientras que redujo el porcentaje de Proteobacterias (0,335 frente a 0,173) y Firmicutes (0,389 frente a 0,330) en comparación con el grupo PA a nivel de filo (P < 0,05). A nivel de género (Figuras 6E-K), la suplementación de probióticos disminuyó la abundancia relativa de Acinetobacter (0,136 frente a 0,071) y Streptococcus (0,068 frente a 0,023), mientras que aumentó la abundancia relativa de Bacteroides (0.068 frente a 0,155), Roseburia (0,02 frente a 0,04), Faecalibacterium (0,031 frente a 0,060) y Parabacteroides (0,16 frente a 1,92%).

Discusión

La limpieza intestinal es necesaria durante la colonoscopia, y su uso prolongado de seguridad hace que la gente ignore su impacto negativo en los microorganismos intestinales (16). Como sabemos, los microorganismos colónicos son la base para promover las funciones fisiológicas normales de los mamíferos, incluyendo la angiogénesis, el metabolismo, la digestión y el desarrollo del sistema inmunológico (17). Es más, varias enfermedades, como la obesidad, la diabetes de tipo 2, el cáncer colorrectal y la enfermedad inflamatoria intestinal se producen cuando la microbiota intestinal está desequilibrada (8, 9, 18).

Los principales componentes del microecosistema intestinal normal son anaerobios obligados (Bacteroidetes y Firmicutes), y los anaerobios facultativos (como las Proteobacterias) suelen representar sólo una pequeña proporción, y el desequilibrio de la microbiota intestinal suele estar causado por el aumento del número de anaerobios facultativos (19). La preparación del intestino puede aportar una gran cantidad de oxígeno a la cavidad intestinal, dañar el entorno anaeróbico de la cavidad intestinal y proporcionar un buen entorno de crecimiento para las bacterias anaeróbicas facultativas o aeróbicas. Estudios anteriores y el presente trabajo, igualmente, demostraron que la preparación del intestino había aumentado en gran medida la abundancia de Proteobacterias.

En este estudio, encontramos que la preparación del intestino disminuyó significativamente los filos Bacteroidetes y Firmicutes (Figura 2), y la toma de probióticos tuvo poco efecto en el filo Firmicutes, mientras que aumentó en gran medida la abundancia de Bacteroidetes (Figura 4). Estudios anteriores habían demostrado que el aumento de la abundancia de Firmicutes y la disminución de la abundancia de Bacteroidetes estaban estrechamente relacionados con condiciones insalubres. Por lo tanto, el aumento de Firmicutes/Bacteroidetes puede suponer un riesgo potencial para la salud del paciente (20-22). En el presente estudio, descubrimos que la proporción de Firmicutes/Bacteroidetes en el grupo CA (3,08) era mayor que en el grupo PA (0,98), lo que sugiere que la toma de probióticos podría reducir los riesgos potenciales de enfermedad mediante la preparación del intestino. Además, el cuerpo humano no suele tener la capacidad de degradar la mayoría de los polisacáridos complejos (el principal componente y la principal fuente de nutrición de nuestra dieta diaria) hasta llegar al colon, y los Bacteroidetes desempeñan un papel vital en la degradación de los polisacáridos complejos de celulosa, pectina y xilano, que pueden ayudar a las personas a absorber más energía de la dieta (23). Además, el butirato producido por los Bacteroidetes desempeña un papel importante en el mantenimiento de la salud intestinal del huésped, ejerciendo la inmunidad y el efecto antitumoral (24).

A nivel de género, la suplementación de probióticos redujo significativamente la abundancia de Acinetobacter, que es una bacteria aeróbica y gramnegativa común en la naturaleza, perteneciente a un patógeno vital causante de infecciones hospitalarias especialmente en pacientes con baja función inmunológica (Acinetobacter baumannii) (25). El Acinetobacter ha sido catalogado como el tercer patógeno humano más común en la unidad de cuidados intensivos de los hospitales de Corea del Sur, y su inherente resistencia a una variedad de antibióticos hizo que obtuviera determinantes de la resistencia a diversos fármacos antibacterianos (26). Además, la preparación del intestino redujo significativamente el nivel de Bacteroides, y los probióticos obviamente recuperaron su abundancia. Los estudios habían revelado que el Bacteroides puede reducir el nivel de oxígeno intestinal para promover el crecimiento de anaerobios estrictos (23) y algunas cepas de Bifidobacterium se han utilizado como probióticos en la alimentación y la medicina (10, 27). Bacteroides y Bifidobacterium pueden establecer un contacto estable y a largo plazo con el huésped y beneficiar la salud del cuerpo humano, pueden degradar la fibra dietética en ácidos grasos de cadena corta (AGCC), lo que proporciona una fuente de energía para las células, promueve la función de barrera y reduce la aparición de reacciones inflamatorias (28, 29).

Al final, comparamos la diversidad microbiana de la AC y la AP, y descubrimos que la toma de probióticos mejoraba predominantemente la abundancia de bacterias beneficiosas como la Roseburia (principalmente o sólo produce butirato, que puede reducir el nivel de inflamación en el conjunto, especialmente en la sangre, reducir aún más el grado de aterosclerosis. Se mantiene en niveles más bajos en personas con enfermedades cardiovasculares) (30, 31), Faecalibacterium (una bacteria simbiótica que existe ampliamente en el tracto gastrointestinal de animales y humanos. Se redujo significativamente en los pacientes de Crohn, y podría utilizarse como probiótico para tratar la enfermedad de Crohn) (32-34) y Parabacteroides (puede resistir la inflamación intestinal, los principales productos finales metabólicos son el ácido acético beneficioso y el ácido succínico, que están por debajo del rango normal en el tracto intestinal de los pacientes con colitis) (35-37) a nivel de género. Sin embargo, la abundancia de bacterias nocivas, como Streptococcus, se redujo notablemente (figuras 5 y 6). El Streptococcus es un patógeno oportunista común, que incluye el Streptococcus pyogenes, el Streptococcus viridans y el Streptococcus pneumoniae, que pueden causar inflamación purulenta, endocarditis y septicemia, amenazando aún más la salud y la vida humanas (38, 39). Haenni et al. indicaron que, debido al uso generalizado de antibióticos tetraciclinas, macrólidos y lincosamidas en el sector animal mundial, ha surgido la resistencia a los antibióticos del Streptococcus zooepidermidis, lo que conduce al fracaso del tratamiento (40, 41).

En el presente estudio, encontramos que los probióticos orales aliviaron la alteración microbiana intestinal causada por la preparación del intestino, reduciendo en gran medida los patógenos de Proteobacteria (a nivel de filo), Acinetobacter (a nivel de género), Streptococcus (a nivel de género), y aumentó los probióticos de Bacteroidetes (a nivel de phylum), Bacteroides (a nivel de género), Roseburia (a nivel de género), Faecalibacterium (a nivel de género) y Parabacteroides (a nivel de género). Por lo tanto, tenemos razones para creer que el suplemento de preparaciones probióticas acelerará el establecimiento del equilibrio microbiano intestinal después de la limpieza intestinal, suprimirá el crecimiento de bacterias dañinas y beneficiará el mantenimiento de la salud intestinal.

Declaración de disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados para este estudio se pueden encontrar en el NCBI: GenBank número de acceso PRJNA597277.

Declaración ética

Los estudios con participantes humanos fueron revisados y aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Nanchang (Nanchang, China). El proyecto también ha sido registrado y aprobado por el Centro de Registro de Ensayos Clínicos de China (ChiCTR1900022539). Los pacientes/participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

Contribuciones de los autores

TC y XD diseñaron los experimentos, analizaron los datos y redactaron el manuscrito. CZ, HT, RY, ZL, YH y KW realizaron los experimentos. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito final.

Financiación

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención nº 81960103 a XD), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangxi (subvención nº 20192ACBL20034 a ZL), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Jiangxi (subvención nº. 20181BBG70028, 20181BCB24003 y 20194BCJ22032 a TC), y el doble plan 10 mil de la provincia de Jiangxi a TC (profesionales de la innovación y la tecnología como el talento de alta gama).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.