Tanto la BR desnaturalizada como la nativa pueden unirse a GroEL
El mecanismo de la actividad de GroEL se basa en su capacidad para reconocer una amplia gama de polipéptidos, principalmente a través de interacciones entre los residuos hidrofóbicos del sustrato y las hélices H e I de los dominios apicales de GroEL (Fig. 1A) (Coyle et al. 1997). Aquí, la unión de la BR desnaturalizada y nativa a GroEL se examinó primero por calorimetría de titulación isotérmica (ITC), ya que cada estado tiene abundantes residuos superficiales hidrofóbicos que son fácilmente accesibles a GroEL. Como se muestra en la Fig. 2A, la valoración de GroEL con BR produce termogramas de valoración exotérmica en ambos casos. Los cambios de calor se deben específicamente a la unión de BR a GroEL, ya que la inyección consecutiva de BR en los tampones de ensayo sin la chaperonina produce termogramas planos (Fig. S1 suplementaria). El calor de cada inyección que se muestra en la Fig. 2A se integró, se corrigió por el calor de dilución y se graficó contra la proporción molar de BR: GroEL (Fig. 2B). El cambio de calor se ajusta a un modelo de unión de sitios (curvas rojas y azules), produciendo una constante de disociación (Kd) cerca de 0.3 nmol/L para el BR desnaturalizado y cerca de 6.0 nmol/L para el BR nativo, respectivamente (Tabla 1). Así, la desnaturalización de la BR aumentó la afinidad de unión de GroEL a esta proteína de membrana en un orden de magnitud. Por otra parte, la unión de cualquiera de las dos muestras de BR está impulsada por un cambio de entalpía favorable (ΔH) y opuesta por un cambio de entropía negativo (ΔS); la estequiometría de unión (N) determinada en ambos casos es cercana a la unidad (Tabla 1). Sin embargo, la unión del BR nativo es claramente menos entálpica con menor compensación de entropía.
La unión del BR a GroEL evaluada por ITC. A Valoración de GroEL con BR desnaturalizado por SDS (dBR, rojo) o BR nativo (nBR. azul). Los termogramas se registraron a 20 °C con un instrumento MicroCal ITC200. B Se integró el intercambio de calor de cada inyección en A y se representó frente a la relación molar BR:GroEL. Las líneas continuas representan el ajuste de los datos a un modelo de conjunto único de sitios (todos los sitios son idénticos y equivalentes) y los parámetros termodinámicos obtenidos se enumeran en la Tabla 1
La cochaperonina GroES con forma de tapa es un componente esencial en el plegamiento de proteínas mediado por GroEL en bacterias, y se ha demostrado que comparte los mismos sitios de unión en GroEL con el sustrato (Chen y Sigler 1999). La valoración de GroEL con BR desnaturalizado en presencia de GroES indica que GroES tiene poco efecto en la unión a BR (Fig. S2 suplementaria y Tabla 1). Este resultado puede entenderse teniendo en cuenta la Kd, que para la formación de un complejo GroEL/ES se determinó previamente como 3 μmol/L y es significativamente mayor que la del complejo BR-GroEL determinada aquí (Behlke et al. 1997). Esto indica una interacción mucho más débil de las dos proteínas chaperoninas y, por tanto, es coherente con el efecto insignificante. Sin embargo, en presencia de ATP, que regula los ciclos de unión y liberación de GroEL y GroES in vivo, la afinidad de GroEL/ES aumentaría tres órdenes de magnitud (normalmente Kd ~1 nmol/L) (Farr et al. 2000), teóricamente capaz de competir con la unión de BR a GroEL. Posteriormente se investigó el efecto de apoGroEL en el plegado de BR y, a continuación, el papel de GroES y ATP en este proceso.
El sistema GroEL-GroES puede modular el plegado de BR en presencia de DDM
Se observó que una porción de BR desnaturalizada por SDS se volvía a plegar cuando se diluía con un exceso de detergente solubilizante n-dodecil-β-D-maltosido (DDM), como se reveló midiendo la recuperación de la absorción de la retina (Fig. suplementaria S3) (Booth 1997). No se detectó una recuperación significativa en el tampón de ensayo sin detergente o complementado sólo con GroEL. Sin embargo, en presencia de DDM, la adición de GroEL mostró un efecto evidente en el plegamiento de la BR (Fig. S3 suplementaria). La constante de velocidad para el plegamiento mediado por GroEL (0,15 μmol/L), evaluada mediante el ajuste con cinética exponencial simple, se estimó que era ~dos veces menor que el plegamiento espontáneo. Se sabe que GroEL suele retrasar el plegado de las proteínas solubles que pueden plegarse eficazmente en su ausencia. Esto se ha explicado a través de una competencia entre el plegamiento intramolecular y la unión intermolecular a GroEL (Gray y Fersht 1993; Itzhaki et al. 1995). Parece totalmente plausible que GroEL se comporte de forma similar en el repliegue de la BR desnaturalizada. Cuando se aumentó la concentración de GroEL a 0,30 μmol/L, la constante de velocidad estimada no cambió de forma evidente, mientras que el rendimiento del plegado alcanzó un nivel mucho más alto que el plegado espontáneo después de 60 min (Fig. S3 suplementaria). Estos datos demuestran que apoGroEL puede disminuir la tasa de plegado de BR pero mejorar el rendimiento de la proteína plegada.
Debido a que las células bacterianas contienen varios milimoles de ATP y en condiciones normales, la relación molar relativa de GroES frente a GroEL es de 1,9 y tras el choque térmico de 4,7 (Moparthi et al. 2013); es poco probable que GroEL permanezca mucho tiempo sin unir ATP y GroES. En presencia de ATP (azul en la Fig. 3A), la recuperación de la BR correctamente plegada fue significativamente más rápida y mayor comparada con la de apoGroEL sola o el proceso espontáneo (rojo y negro en la Fig. 3A). Por el contrario, la combinación de GroEL y GroES mostró poco efecto en la tasa de plegado espontáneo pero redujo el rendimiento en cierta medida (Fig. 3A, cian). Esto indica una interacción entre GroEL y GroES sin necesidad de ATP, probablemente inducida por el BR unido a GroEL, que a su vez tuvo un efecto adverso en la recuperación de la proteína correctamente plegada. Cuando se utilizó el sistema completo de chaperoninas (Fig. 3A, verde), se observó un aumento máximo de la tasa pero el rendimiento de plegado cayó entre los dos casos anteriores.
Curso temporal del plegado de BR modulado por el sistema GroEL-GroES dependiente de ATP. A La recuperación del BR plegado se monitorizó continuamente con absorbancia a 554 nm. Se realizaron las siguientes adiciones: ninguna (negro); 0,3 μmol/L de GroEL (rojo); 0,3 μmol/L de GroEL y 5 mmol/L de ATP (azul); 0,3 μmol/L de GroEL y 0,6 μmol/L de GroES (cian); 0,3 μmol/L de GroEL, 0,6 μmol/L de GroES y 5 mmol/L de ATP (verde). B El plegamiento de BR mediado por GroEL neto se llevó a cabo en primer lugar; luego, a T = 60 min, la muestra se complementó con solo ATP, con solo GroES o con ambos, como se indica. C Para comparar con A, también se analizó el efecto de la versión de GroEL de anillo único (SR1) no ciclada sobre el plegamiento de la BR. Las concentraciones de SR1, GroES y ATP utilizadas fueron 0,6 μmol/L, 1,2 μmol/L y 5 mmol/L, respectivamente. D Los efectos de GroEL/ES más ATP en el pliegue nativo de BR se examinaron siguiendo el cambio de absorbancia a 560 nm. Las concentraciones de chaperonina y nucleótido utilizadas en B y D fueron las mismas que en A. La BR se mantuvo a 2,4 μmol/L en todos los experimentos. Las líneas azul y verde en A y la línea azul en C representan el ajuste de los datos a la ecuación exponencial trifásica, mientras que las líneas restantes son el ajuste con la ecuación exponencial simple. Todas las líneas en B y D son simples guías para los ojos
Los resultados anteriores indican que el ATP y GroES pueden influir en el plegamiento del BR mediado por GroEL de manera diferente. La unión de GroES a GroEL es algo perjudicial para el plegado, en contraste con el conocido papel positivo de la encapsulación del sustrato en la jaula de GroEL/ES para el plegado asistido (Jewett y Shea 2010). A continuación nos preguntamos cómo se produce este efecto adverso. Intrigantemente, GroES solo o su secuencia de bucle móvil a través de la cual GroES se une a GroEL también facilitó la recuperación del BR plegado (Fig. S4 suplementaria). Además, la secuencia de bucle mostró un efecto similar al de GroES en el plegamiento mediado por GroEL en ausencia y presencia de ATP (Fig. S4 suplementaria). Aunque no puede formar una tapa sellada sobre la cavidad central de GroEL como GroES, lo que implica una contribución significativa de la interacción bucle-GroEL al plegamiento. Notablemente, los residuos hidrofóbicos en la superficie apical de GroEL implicados en la unión del bucle móvil de GroES se solapan en su mayoría con los implicados en la unión de la proteína sustrato (Motojima et al. 2000). Es poco probable que el BR hidrofóbico fuera desplazado y liberado dentro de la jaula hidrofílica de GroEL/ES por el bucle móvil, especialmente dada la presencia de micelas de DDM fuera de la jaula, lo que favorecería aún más el plegamiento o la solubilización del BR. Preferiblemente, como se ha demostrado para el plegado asistido de varias proteínas solubles (Motojima y Yoshida 2010), la BR puede ser capturada cerca de la interfaz GroEL/ES, sobresaliendo en parte hacia el exterior cuando se utilizó el sistema completo o incluso GroEL/ES solo en este estudio. Dicha interacción puede impedir que BR acceda a las micelas DDM favorables, dando lugar así al reducido rendimiento de plegado observado tanto con GroES como con su bucle móvil.
Sin embargo, algunos estudios sugieren que el papel de ATP y GroES es únicamente el de disociar sustratos pegajosos (es decir, con una Kd en la región de nmol/L determinada aquí), que limitan la tasa de plegado asistida o incluso inhiben la actividad de plegado de GroEL si no se eliminan (Priya et al. 2013). Para comprobar si GroES y ATP muestran un efecto similar en el plegamiento asistido de BR, primero incubamos apoGroEL con BR desnaturalizado durante 60 min; después, añadimos GroEL o/y ATP (Fig. 3B). La adición posterior de cualquiera de los componentes promovió aún más el plegado del BR, pero fue menos eficaz que la adición simultánea de ambos, lo que demuestra el sinergismo entre ambos para ayudar al plegado mediado por GroEL. Las mediciones de anisotropía con péptidos transmembrana de la BR, que se utilizaron como miméticos de la BR desnaturalizada para evitar las complicaciones introducidas por la naturaleza dinámica de la BR desnaturalizada y de las interacciones GroEL-BR, mostraron que sólo la combinación de ATP y GroES fue capaz de separar eficazmente el complejo péptido-GroEL preformado (Fig. S5 suplementaria). Así, parece que tanto GroES como ATP son necesarios para disociar los conformadores de BR de alta afinidad y regenerar los sitios de unión (o catalíticos) de GroEL estancados.
Para examinar más a fondo el efecto de GroES y ATP en el plegamiento de BR mediado por GroEL, utilizamos un mutante de GroEL de un solo anillo (SR1) que forma un complejo estable con GroES (Weissman et al. 1995), en contraste con el sistema GroEL-GroES cíclico. De forma similar a lo observado con GroEL, el ATP aumentó la tasa y el rendimiento del plegamiento mediado por SR1 (azul en la Fig. 3C), mientras que la presencia de GroES redujo considerablemente ambos aspectos (cian) en comparación con el caso de apoSR1 solo o el proceso espontáneo (rojo o negro). Como se determinó por ITC que el BR desnaturalizado se unía al SR1 con una estequiometría cercana a la unidad (Fig. S2 suplementaria), y el SR1 utilizado tenía el doble de concentración que el GroEL, especulamos que se formaron más complejos BR-SR1 que BR-GroEL, por lo que GroES ejerció más influencia en el plegamiento (cian). Como se esperaba, la adición tanto de ATP como de GroES mostró un efecto insignificante en la recuperación de BR (verde), atribuible a la unión irreversible de GroES a SR1 en presencia de ATP (Weissman et al. 1995). Además, este resultado indica que la mejora de la tasa máxima observada con GroEL se debe a los múltiples ciclos de unión y liberación de GroES regulados por el ATP.
GroEL solo o en combinación con ATP o/y GroES mostró una influencia insignificante en la estructura de la BR nativa solubilizada con DDM (Fig. 3D), lo que apunta a una interacción intramolecular más fuerte dentro de la proteína nativa que la unión intermolecular con GroEL. Por lo tanto, la transición mediada por la chaperonina de la BR desde el estado metaestable desnaturalizado al estado nativo es termodinámicamente favorable.
La evidencia tanto de la desagregación como del desdoblamiento mediado por la chaperonina
La medición del plegado espontáneo de la BR a concentraciones variadas demuestra que la agregación resultó en una recuperación sólo parcial de la BR correctamente plegada y la tasa aparente fue independiente de la concentración, lo que implica que la agregación fue irreversible (Fig. S6 suplementaria). En ausencia del detergente solubilizante DDM, se estimó mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) que la BR desnaturalizada por SDS tenía un coeficiente de difusión (~67 μm2/s) mucho menor que la unida a GroEL (~104 μm2/s) (Fig. 4). Esto refleja que los agregados formados por la BR desnaturalizada son incluso más grandes que el complejo BR-GroEL con una estequiometría de unión cercana a la unidad, como se determinó por ITC. Esto también significa que GroEL fue capaz de interrumpir la estructura de agregación, bombeando esencialmente la vía de plegado productivo con el BR monomérico. Además, se determinó que el nBR solubilizado con DDM tenía un coeficiente de difusión de ~117 μm2/s, que es mayor que el del dBR con GroEL y mucho mayor que el del dBR solo (Fig. 4). Esto sugiere que nBR se dispersó bien en presencia de DDM y también apoya la idea de la desagregación de dBR mediada por GroEL. Además, cuando se añadió el sistema completo de chaperoninas en el BR desnaturalizado, se observaron inmediatamente precipitados blancos floculentos (datos no mostrados), indicando un desdoblamiento forzado así como un sinergismo entre GroES y ATP en este aspecto. Sin detergentes solubilizantes o lípidos que imiten a las membranas biológicas en la solución a granel, el BR desplegado se agregaría y precipitaría instantáneamente, en contraste con el significativo aumento de la velocidad de plegado observado en presencia de DDM.
Inserción en la membrana del BR mediada por GroEL-GroES
Para determinar si GroEL-GroES apoyaría la integración del BR en la bicapa, se prepararon vesículas de membrana citoplasmática invertida (IMV) a partir de células de Escherichia. coli y se mezclaron con BR desnaturalizado en presencia y ausencia de apoGroEL, o más ATP/GroES (Fig. 5A). El apoGroEL provocó un cambio insignificante en la recuperación del BR correctamente plegado en las IMV, según se midió por espectroscopia UV-Vis (negro y rojo). A diferencia del replegado en las micelas DDM, la adición de GroEL y ATP demostró ser perjudicial para la inserción en la membrana (azul), mientras que GroEL combinado con GroES facilitó este proceso (cian). No se conoce la verdadera razón de esta diferencia reproducible, pero la rigidez de las IMV y el cambio estructural de la BR unida a GroEL inducido por la unión de ATP o GroES podrían ser posibles razones. En concreto, se sabe que la unión de ATP por parte de GroEL provoca una expansión de la apertura a la cavidad de la chaperonina (Skjaerven et al. 2015). Este cambio es más apreciable que el causado por la mera unión de GroES a GroEL (Kim et al. 2005), permitiendo así posiblemente el despliegue del sustrato unido (Lin et al. 2008; Sharma et al. 2008), favorable al plegamiento productivo en un disolvente apropiado. Sin embargo, a diferencia de las micelas DDM que son altamente dinámicas, las IMVs probablemente fueron incapaces de proteger rápidamente la especie BR desplegada y proporcionar oportunamente un microambiente de plegado ventajoso. En comparación, la débil asociación de GroES con GroEL en ausencia de ATP podría entregar el BR a las IMVs preparadas de una manera más eficiente. Sin embargo, de forma similar al replegamiento en micelas DDM, el sistema completo GroEL-GroES mejoró en gran medida la inserción de BR en la membrana (verde), que alcanzó un estado estable rápidamente con la cantidad de BR recuperada que se situó entre los dos casos anteriores.
Inserción de BR en IMVs mediada por el sistema GroEL-GroES. A La inserción y/o el replegamiento del BR desnaturalizado (2,4 μmol/L) en las IMVs se monitorizó continuamente con absorbancia a 554 nm. Se realizaron las siguientes adiciones: ninguna (negro); 0,3 μmol/L de GroEL (rojo); 0,3 μmol/L de GroEL y 5 mmol/L de ATP (azul); 0,3 μmol/L de GroEL y 0,6 μmol/L de GroES (cian); 0,3 μmol/L de GroEL, 0,6 μmol/L de GroES y 5 mmol/L de ATP (verde). B El BR nativo puede ser transferido eficientemente a las IMVs en presencia de GroEL con la ayuda de ATP y GroES. Las concentraciones probadas de BR nativo, GroEL, GroES y ATP fueron 0,4, 5, 10 μmol/L y 5 mmol/L, respectivamente
A continuación, se empleó la anisotropía de fluorescencia para sondear los efectos de las chaperoninas bacterianas en la inserción del BR en las IMV (Fig. 5B). Cuando la BR nativa marcada con fluorescencia se mezcló con una cantidad excesiva de GroEL, la anisotropía se desplazó a un valor más alto, demostrando que la proteína de membrana formaba un complejo estable con la chaperonina. Es importante destacar que la adición posterior de IMVs condujo a un aumento adicional de la anisotropía, lo que indica la integración de la BR en las IMVs. Se descubrió que el ATP y GroES aumentaban aún más la transferencia de BR a la membrana, como se juzga también por el aumento de la anisotropía. Estos resultados plantean la posibilidad de que GroEL, junto con GroES y ATP, pueda tener un papel directo en la integración de las proteínas en la bicapa lipídica in vivo.