Abstract
La glucógeno fosforilasa es una enzima importante para el metabolismo de los carbohidratos en el músculo. Utiliza el fosfato inorgánico para eliminar la glucosa del glucógeno, produciendo glucosa-1-fosfato, que puede utilizarse para la producción de ATP. La fosforilasa de glucógeno inactiva (fosforilasa h) se activa por la unión alostérica de 5′-AMP o por fosforilación por parte de la fosforilasa quinasa (PhK). La fosforilación produce la fosforilasa a, que es activa en ausencia de AMP. La PhK es la única quinasa que puede fosforilar la fosforilasa b, que a su vez es el único sustrato de la PhK. Esta investigación de tesis ha intentado determinar las razones de esta especificidad y cómo estas dos enzimas se reconocen mutuamente, estudiando mutantes dirigidos al sitio de la fosforilasa de glucógeno; Todos los mutantes fueron ensayados para los cambios en su interacción con una forma truncada de la subunidad catalítica de la fosforilasa quinasa, gamma(1–300). Tres mutaciones (R69K, R69E y E501A), realizadas en sitios que interactúan con el extremo amino de la fosforilasa b o a, mostraron poca diferencia en la fosforilación por gamma(1–300) en comparación con la fosforilasa b. Sin embargo, cinco mutaciones, realizadas en tres sitios de la cola aminoterminal de la fosforilasa (K11A, K11E, I13G, R16A y R16E), produjeron disminuciones en la eficiencia catalítica para la gamma(1–300), en comparación con la fosforilasa b. R16E fue el sustrato más pobre para la gamma(1–300), dando una disminución de 47 veces en la eficiencia catalítica. El amino-terminal, y especialmente la Arg 16, son factores muy importantes para el reconocimiento de la fosforilasa por la gamma(1–300). Además, I13G y R16A pudieron ser fosforiladas por la proteína quinasa A, que no reconoce la fosforilasa nativa;También se observó que algunos de los mutantes tenían estados conformacionales alterados. R16A y R16E se activaron a una concentración muy baja de AMP y cristalizaron a baja temperatura, como la fosforilasa a. Esto indica que, incluso sin fosforilación, sus estructuras son más parecidas a la fosforilasa a que a la fosforilasa b. Otros dos mutantes produjeron el efecto contrario, comportándose como la fosforilasa b tras la fosforilación. El R69E sólo se activó parcialmente por fosforilación, y el I13G fue completamente inactivo tras la fosforilación. I13G fue la primera observación de una forma de fosforilasa que no podía ser activada por fosforilación.